Стр. 4
Страницы:
Стр.1 |
Стр.2 |
Стр.3 |
Стр.4 |
Стр.5 |
Стр.6 |
Стр.7 |
Стр.8
Этот метод аналогичен методу параллельных проб. Отличие
заключается лишь в том, что лаборант выборочно исследует повторно
одну или две пробы. Таким путем можно оценить воспроизводимость
результатов исследования.
Исследование повторных проб
Для этого несколько случайно выбранных проб исследуется
повторно. Сравнение соответствующих пар результатов дает объективные
данные о качестве проведенных исследований. При проведении этого
метода 5% образцов должны исследоваться повторно. Метод дает
возможность оценить качество работы лаборанта и аппаратуры.
Исследование смешанных проб
Метод смешанных проб состоит в следующем: из группы образцов
случайно выбирают два (А и Б); из каждого образца берут равные
объемы и смешивают (получают образец С). Исследуют все три образца.
Данные первого и второго образцов складывают и делят пополам. Затем
определяют различия между величиной, полученной в смешанной пробе и
средней первого и второго образцов. Для построения контрольной карты
по этому методу рекомендуют проводить исследования смешанных проб в
течение 30-40 дней.
Таблица 12
Определение воспроизводимости по смешанным пробам
------------------T------T------T-------T-----------T---------------
Компонент ¦ А ¦ В ¦ С ¦ (А+В)/2 ¦ Различие
------------------+------+------+-------+-----------+---------------
Гемоглобин, г/л 125 142 130 133,5 3,5
Гематокрит, л/л 0,47 0,52 0,50 0,495 0,5
--------------------------------------------------------------------
Метод контроля по результатам проб пациентов
Это метод текущего контроля, который не требует специального
контрольного материала и помогает обнаружить ошибки, являясь
действительным контролем на весь процесс анализа. В этом случае для
построения контрольной карты необходимо осуществить следующие этапы:
1. Выписать нормальные результаты отдельного теста за день,
отбросив все патологические результаты.
2. Если количество результатов превышает 50, то использовать
только первые 50, если более 200, то использовать только первые и
последние 25 нормальных результатов.
3. Рассчитать среднее значение за день.
4. Продолжать также на протяжении месяца. _
5. Рассчитать среднее значение за месяц (X) и соответствующее
среднее квадратичное отклонение (S).
6. Построить контрольную карту со значениями +-2S.
7. Ежедневно откладывать результат средней нормальных величин
на контрольной карте. Величины, укладывающиеся вне контрольного
диапазона, указывают, соответственно, на завышение или занижение
результата в день выполнения исследования.
IX. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ
Для контроля правильности определения гемоглобина используют
стандартный раствор гемоглобина или контрольный материал с
нормальным, повышенным и сниженным содержанием гемоглобина, контроля
воспроизводимости - консервированную или стабилизированную кровь
(гемолизат).
Фиксированные клетки крови человека или животных применяют для
контроля качества подсчета клеток крови, контрольные мазки
(окрашенные и неокрашенные с нормальной лейкоцитарной формулой и с
патологией) - используют при проведении контроля качества счета
лейкоцитарной формулы.
Контроль содержания гемоглобина.
Стандартный раствор и контрольные растворы гемоглобина 3-4
уровней применяются для контроля правильности и построения
калибровочной кривой. Для контроля воспроизводимости определения
гемоглобина применяют растворы гемолизированной крови. Чтобы
приготовить гемолизат берут консервированную или свежую нитратную
человеческую кровь.
Свежую кровь в количестве 100 мл (можно меньше) собирают в
сосуд с 0,6 моль/л раствором лимоннокислого натрия из расчета 5:1.
Цитратную кровь центрифугируют при 3000 об/мин 10-15 мин. Плазму
сливают. К осадку эритроцитов добавляют 50 мл стерильной
дистиллированной воды, тщательно перемешивают на магнитной мешалке
(или вручную) в течение 30 мин. Гемолизат помещают на 24 часа в
холодильник при -20°С. После этого раствор размораживают и вновь
перемешивают. Раствор гемолизата фильтруют в стерильных условиях и
разливают в стерильные ампулы и баночки по 1 мл. Хранят в
холодильнике при -20°С. Раствор стабилен в течение года.
Для оценки воспроизводимости определений гемоглобина гемолизат
исследуют в течение 20 дней, из полученных данных рассчитывают
_
среднюю величину (X), среднеквадратическое отклонение (S),
контрольные пределы (+-2S) и строят контрольную карту. Коэффициент
вариации не должен превышать 5%. При возможности установить точную
концентрацию гемоглобина в гемолизате его можно использовать для
контроля правильности. Определяя концентрацию гемоглобина в крови,
необходимо избегать следующих ошибок:
1. Неправильный забор крови (гемолиз, сгустки, неточность
забора).
2. Использование неточных пипеток на 0,02 мл и на 5 мл.
3. Неполное заполнение пипетки кровью.
4. Неточное пипетирование раствора для определения
гемоглобина.
5. Недостаточно чистая посуда (следы крови или детергента).
6. Неточно откалиброван прибор (неточная концентрация
стандарта).
7. Грязные кюветы или мутность растворенной пробы.
8. Несвоевременность исследования.
Контрольные материалы для подсчета числа эритроцитов
Контрольная кровь представляет собой взвесь стабилизированных
клеток. Наиболее часто фирмы производят контрольную кровь с 8
гематологическими параметрами: число лейкоцитов, эритроцитов,
тромбоцитов, концентрация гемоглобина, величина гематокрита, средний
объем эритроцитов, усредненное содержание гемоглобина в одном
эритроците и в общем объеме эритроцитов. Контрольные образцы с 12
параметрами дополнительно включают средний объем тромбоцитов,
процентное соотношение содержания лимфоцитов, моноцитов,
гранулоцитов.
1. Консервированная кровь. Консервированную кровь сохраняют вне
организма в течение длительного срока с поддержанием всех
биологических и функциональных свойств. Консервированная кровь
должна сохраняться без явлений деструкции эритроцитов.
Для приготовления консервированной крови в качестве
стабилизаторов используются антикоагулянты, и на основе этих веществ
предложены следующие консервирующие растворы (рН растворов доводят
до требуемого значения 0,1 моль/л NаОН):
I. 1. Натрий лимоннокислый (цитрат натрия) - 2 г (ч, чда).
2. D(+) - Глюкоза - 3,0 г, безводная (ч, чда).
3. Левомицетин - 0,075 г (фарм).
4. Дистиллированная вода- до 100 мл.
рН раствора доводится до 4,5-5,1. Консервированная кровь
готовится путем добавления к крови консервирующего раствора в
отношении 4:1.
II. 1. Лимонная кислота - 1,0 г (чда, хч).
2. D(+) - Глюкоза- З г, безводная (чда).
3. Натрий фосфорнокислый трехзамещенный - 0,75 г (ч, чда).
4. Дистиллированная вода - до 100 мл.
рН раствора доводят до 5,7 (5,5-6,0). Консервированную кровь
готовят путем добавления к крови консервирующего раствора в
отношении 4:1.
III. 1. Глюкоза - 25 г, безводная (ч, чда).
2. Натрий лимоннокислый - 22 г (чда).
3. Лимонная кислота - 8 г (чда, хч).
4. Дистиллированная вода - до 1000 мл.
рН раствора доводится до 6,4. Консервированная кровь готовится
путем добавления к крови консервирующего раствора в отношении 3:1.
IV. 1. D(+) - Глюкоза - 2,0 г, безводная (ч, чда).
2. Натрий лимоннокислый - 300,0 г (ч, чда).
3. Натрий фосфорнокислый безводный однозамещенный - 0,15 г (ч,
чда).
4. Дистиллированная вода - до 1000 мл.
рН раствора доводится до 6,9. Консервированная кровь готовится
путем добавления к крови консервирующего раствора в отношении 2:1.
V. 1. D(+) - Глюкоза - 20,5 г, безводная (ч, чда).
2. Натрий лимоннокислый - 8,0 г (ч, чда).
3. Лимонная кислота - 0,55 г (чда, хч).
4. Натрий хлористый - 4,2 г (ч, чда, хч).
5. Дистиллированная вода - до 1000 мл.
рН раствора доводится до 6,1. Консервированная кровь готовится
путем добавления к крови консервирующего раствора в отношении 4:1.
В консервированных растворах эритроциты сохраняют свои
функциональные и биологические свойства в течение нескольких дней
при Т 20-22°С, а в условиях холодильника - до 20-30 дней.
Контроль качества определения эритроцитов с помощью контрольных
материалов осуществляется следующим образом: в течение 20 дней
проводят 2 определения количества эритроцитов в консервированной
крови, рассчитывают среднюю величину, пределы колебаний и строят
контрольную карту (см.табл.13).
Таблица 13
Пример расчета и построения контрольной карты для контроля
качества подсчета эритроцитов в крови
*****НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ
Неудовлетворительная воспроизводимость результатов может быть
обусловлена ошибкой в подсчете количества клеток в крови,
неравномерным распределением клеток в камере.
Контроль качества подсчета
лейкоцитарной формулы в мазках крови
Необходимой предпосылкой для правильного учета морфологических
особенностей клеток крови является удачно сделанный и хорошо
окрашенный мазок крови. Невыполнение одного из этих условий ведет к
неправильному распределению клеток крови или плохому выявлению их
морфологических особенностей, а вместе с тем и к ошибкам в
определении. Хорошо сделанный мазок крови должен отвечать следующим
условиям:
1. Мазок должен начинаться на 1-1,5 см от узкого края
предметного стекла и кончаться в 2-3 см от его другого края. Общая
длина мазка должна охватывать 0,5-0,75 площади стекла.
2. Мазок должен быть равномерной толщины, а не волнообразным.
Хороший мазок крови толще всего вначале, постепенно утончается и
заканчивается в виде следа как бы оставленного тонкой щеткой.
3. Мазок должен быть "свободным с края". Другими словами, слой
крови не должен достигать длинного края стекла, а между ним и краем
должно оставаться расстояние в несколько миллиметров. Мазки,
превышающие 3/4 общей длины предметного стекла, очень толсты.
Эритроциты в большей части такого препарата прижаты один к другому
или ложатся монетными столбиками. Это мешает правильно исследовать
их морфологию. Мазки короче 1/2 предметного стекла очень тонки.
Лейкоциты отделены друг от друга, сильно деформированы и неправильно
распределяются. Отсутствие свободных от крови краев означает, что
использованное при приготовлении мазка шлифовальное стекло касалось
края предметного стекла. В таких случаях большие клетки перемещаются
к краю мазка и это вызывает неправильное распределение клеток. В
неравномерном (волнообразном) мазке распределение клеток крайне
неудовлетворительно. Толстые участки содержат больше лимфоцитов,
тонкие - больше моноцитов и сегментоядерных клеток. Для
доброкачественного исследования морфологии клеток большое значение
имеет правильная его фиксация и окраска.
Источники ошибок
Правильная фиксация мазка придает стойкость форменным элементам
крови по отношению к содержащейся в красках воде, которая без
фиксации мазка гемолизирует эритроциты и изменяет строение
лейкоцитов. Фиксация мазка, вызывая коагуляцию белка, прикрепляет
препарат к стеклу. В качестве фиксаторов предложены: метиловый
спирт, этиловый спирт, смесь Никифорова, состоящая из равных частей
этилового спирта и серного эфира. Лучшим фиксатором является
метиловый спирт. Недостаточная фиксация мазка дает слабую окраску
нейтрофильной зернистости лейкоцитов и ведет к некачественной
окраске клеток.
Качественная окраска мазка позволяет правильно дифференцировать
клетки крови и их структуру при микроскопическом исследовании. При
применении любой методики окрашивания мазка крови важно точно
соблюдать методические правила приготовления растворов и временные
промежутки в течение процесса окрашивания. При приготовлении
растворов необходимо учитывать рН воды; она должна быть нейтральной.
Партии красителя, существующие в продаже, имеют различную
интенсивность окраски. Это обязывает опытным путем установить
оптимальную концентрацию (разведение) и время окрашивания для
каждого флакона красителя, которые устанавливаются путем окрашивания
серии препаратов растворами с различной концентрацией красителя,
меняя длительность его воздействия.
Для контроля качества подсчета лейкоцитарной формулы в мазках
крови используют контрольные мазки. Их готовят из капиллярной крови
доноров и больных на предметных стеклах, выполняя требования к
правильному приготовлению мазков, фиксации и окрашиванию. Затем
контрольные мазки многократно просчитываются (не менее 20 раз) по
200 клеток (не менее 5 квалифицированных специалистов). Из
полученных данных статистически рассчитывают критерии определения
_
правильности подсчета мазка путем расчета Х и +-2S. Контрольные
образцы, нормальные и патологические, регулярно вводятся в поток
клинических образцов и с их помощью проверяют качество работы
каждого сотрудника лаборатории. Подсчет считается правильным, если
результаты подсчета клеток входят в рассчитанные контрольные границы
_
Х +-2S для каждого вида клеток крови.
Суспензия фиксированных эритроцитов
Фиксация эритроцитов приводит к физико-химическим изменениям в
мембране эритроцитов, что предохраняет клетки от лизиса. В качестве
фиксирующего материала предложены формальдегид, танин,
глутаральдегид, ледяная уксусная кислота. Наибольшее распространение
получила методика фиксации эритроцитов глутаральдегидом. После
фиксации размер клеток изменяется в течение первых 3-4 дней, затем
остается стабильным от нескольких месяцев до нескольких лет.
Методика приготовления
Кровь собирают в сосуд с антикоагулянтом ЭДТА (5 мг сухого ЭДТА
на 1 мл крови). Затем плазму трижды промывают изоосмотическим
фосфатным буфером. Для этого к собранной крови добавляют раствор
буфера в 2 раза больше объема крови и полученную суспензию
центрифугируют в течение 10 минут при 3000 об/мин. Промытые
эритроциты фиксируют 0,25% раствором глутаральдегида в фосфатном
буфере, который постепенно добавляют к эритроцитам в отношении 1:10
(кровь:фиксирующий раствор). Фиксация производится при комнатной
температуре в течение часа. Фиксированные эритроциты трижды
промывают дистиллированной водой и доводят до окончательного объема
водой или 12,5% раствором глицина. Затем добавляют 3 мл 1% раствора
азида натрия. Тщательно перемешивают на магнитной мешалке в течение
30 минут и разливают в стерильные стеклянные пузырьки по 2-5 мл.
Хранение проводят при Т 4°С. Перед использованием материал
перемешивают на магнитной мешалке в течение 10 минут. Срок хранения
- от 6 месяцев до 1 года.
Суспензию используют для контроля качества подсчета эритроцитов
автоматическим и камерным методами.
Приготовление изоосмотического фосфатного буфера
154 ммоль/л, рН7,4: 0,246 г однозамещенного фосфорнокислого
калия и 3,187 г двузамещенного фосфорнокислого калия трехводного
растворяют дистиллированной водой в мерной колбе на 100 мл.
Ограничения применения консервированной крови
и фиксированных клеток крови
1. Дефицитность крови.
2. Фиксированные эритроциты обладают большей вязкостью по
сравнению с кровью (прилипают к стенкам и не переходят в состояние
суспензии).
3. Фиксирование клеток изменяет их электрический заряд, что
влияет на правильность результатов при автоматическом подсчете
клеток.
4. Фиксированные клетки более ригидны, что затрудняет их
прохождение через отверстия анализатора и меняет амплитуду пульсовой
волны (при автоматическом подсчете).
5. В первые 3-5 дней происходит уменьшение объема фиксированных
эритроцитов, затем их размеры остаются стабильными в течение 6
месяцев.
6. Дефицитность реактивов (глутаральдегида и азида натрия).
Возможные ошибки при подсчете количества клеток крови
1. При взятии крови:
а) неправильный забор крови (выдавливание из пальца, сгустки,
гемолиз);
б) использование неточно откалиброванных пипеток;
в) неточное пипетирование и разведение крови;
г) недостаточно быстрый забор крови и размешивание ее с
реактивом для разведения.
2. При разведении:
а) неточное пипетирование реактива для разведения;
б) использование грязной посуды и пипеток;
в) использование неточно откалиброванных пипеток;
г) использование некачественного реактива для разведения,
вызывающего гемолиз эритроцитов.
3. При измерении:
а) несоблюдение правил подготовки счетной камеры;
б) несоблюдение временных промежутков при подсчете количества
эритроцитов в камере, необходимых для оседания клеток на сетку;
в) нетщательное перемешивание крови перед заполнением камеры;
г) подсчет клеток в недостаточном количестве квадратов и
несоблюдение правил подсчета;
д) использование неоткалиброванного прибора при автоматическом
подсчете клеток.
Метод сохранения мазков для многократного микроскопирования
К 0,5 мл клея БФ-6 прибавляют 3 мл абсолютного спирта, 3 мл
бутилового спирта и тщательно перемешивают до получения прозрачной
жидкости с желтоватым оттенком. Хранят в склянке с хорошо притертой
пробкой. На предметное стекло с мазком наносят пипеткой большую
каплю пленкообразующей смеси и, покачивая стекло, дают ей равномерно
растечься по его поверхности. Избыток смеси с края стекла удаляют и
препарат кладут на горизонтальную поверхность для высушивания. При
комнатной температуре пленка высыхает 15-20 минут. Для ускорения
сушки мазок можно поместить в термостат при 60°С.
X. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА ИССЛЕДОВАНИЙ МОЧИ
Почки выделяют ценный материал для исследования - мочу,
микроскопический и химический анализ которой многое может рассказать
о состоянии организма. Исследование мочи принадлежит к числу
анализов, к которым чаше всего прибегает практический врач. Это
понятно, ибо правильная диагностическая оценка данных исследования
мочи помогает разобраться не только в почечной патологии, где
правильный диагноз часто совершенно невозможен без анализа мочи, но
также ориентирует его при ряде других заболеваний. Отсюда понятно,
что анализ мочи должен быть произведен у каждого больного.
Степень точности получаемых результатов исследований мочи, в
основном, зависит от квалификации лаборанта, используемого
оборудования, реактивов и методов исследования.
Для получения правильных и воспроизводимых результатов
исследования мочи используют контрольные материалы, близкие по
возможности к образцам мочи пациентов, и контрольные мазки для
контроля качества микроскопических исследований осадка мочи.
Концентрация исследуемых веществ в контрольном материале должна
соответствовать практической чувствительности используемого метода
исследования.
Контрольные материалы с высокими концентрациями веществ могут
давать положительные реакции даже с испорченными реактивами или
полосками с экспресс-тестами, а одной из важных задач контроля
исследования мочи как раз и является выявление даже незначительной
потери в чувствительности исследуемого метода (особенно при
качественных пробах). В качестве контрольных материалов для контроля
химического состава мочи используют:
1. Водные растворы веществ.
2. Сливную мочу с консервантами.
3. Искусственные растворы мочи с добавками веществ, исследуемых
в моче.
Способы приготовления контрольных материалов
Контрольные препараты для микроскопии осадков мочи должны
содержать встречающиеся в моче соли, полиморфные эпителиальные
клетки, различные виды цилиндров, лейкоциты, эритроциты,
болезнетворные и неболезнетворные бактерии, грибы, паразиты
животных. Кроме того, целесообразно иметь препараты с осадками мочи,
характерными для наиболее распространенных заболеваний.
Кроме использования контрольных материалов применяют метод
параллельных проб, смешанных и повторных проб (см.выше).
Водные растворы веществ с известным содержанием используются
для контроля качества исследований (определения или обнаружения)
химического состава мочи (например, раствор глюкозы, мочевины,
альбумина).
Приготовление слитой мочи
Слитая моча используется в качестве контрольного материала для
контроля качества исследований химического состава мочи.
1.1. Реактивы.
1. Слитая человеческая моча, 1 л.
2. ЭДТА, хч, 2,0 г.
3. Изопропиловый спирт, хч, 1 л.
4. Раствор тимола, 5 мл (100 г тимола растворяют в 1 л
изопропилового спирта).
Используются обычно применяемые в лаборатории методы для
качественного и количественного исследования химического состава
мочи.
1.2. Способ приготовления.
К 1 л свежей человеческой мочи добавляют 2 г
этилендиаминтетраацетата натрия (ЭДТА) и при энергичном встряхивании
и перемешивании флакона приливают 5 мл раствора тимола. Через 2
недели мочу центрифугируют для удаления слизи и незначительного
количества мочевой кислоты. После такой обработки моча становится
прозрачной и почти не имеет запаха. Контрольный материал хранят при
комнатной температуре. Срок годности - несколько лет.
1.3. Приготовление контрольных растворов, имитирующих мочу.
Контрольный раствор № 1.
Применяется в качестве контрольного материала для контроля
качества исследований химического состава мочи.
1. Натрий хлористый ч, чда, хч.
2. D(+) - Глюкоза, безводная, ч, чда.
3. Мочевина ч, чда.
4. Ацетон ч, чда.
5. Цельная кровь с величиной гематокрита 0,40-0,45 л/л.
6. Белок сыворотки крови. Используют сыворотку пациента с
исследованным содержанием общего белка или контрольную сыворотку.
7. Хлороформ высокой степени очистки. Используют методы
качественного исследования химического состава мочи.
Способ приготовления
В круглодонную колбу вместимостью 2 л вносят 10 г хлористого
натрия, 10 г мочевины, 1 г глюкозы и 4 мл ацетона (табл.14).
Таблица 14
Перечень добавляемых веществ и их концентрация в конечном растворе
--------------------T-----------------T-----------------------------
¦ Добавляемое ¦ Концентрация вещества в
Вещество ¦ количество ¦ контрольном растворе
¦ вещества ¦
--------------------+-----------------+-----------------------------
NаСl 10,0 г -
Мочевина 10,0 г 83 ммоль/л
Глюкоза 1,0 г 2,775 ммоль/л
Белок 0,8 г 0,4 г/л
Гемоглобин (скрытая 0,2 мл полож.
кровь)
Ацетон 4,0 мл полож.
--------------------------------------------------------------------
Приливают 500 мл воды и перемешивают до полного растворения
солей. Микропипеткой вносят 0,2 мл цельной крови, 0,8 г белка
сыворотки крови. Для расчета необходимого количества сыворотки
используют формулу:
1000 х 0,8
Объем = --------------------
сыворотки содержание белка
мл в используемой сыворотке
Например, если используемая сыворотка содержит 75 г/л общего
белка, то объем сыворотки, содержащей 0,8 г белка, будет равен:
(1000 х 0,8)/75 = 10,7 мл. Затем доводят объем дистиллированной
водой до 2 л и хорошо перемешивают. Для консервации в полученный
раствор добавляют 5 мл хлороформа. Раствор хранят при комнатной
температуре в посуде с притертой пробкой. Срок годности - около
года.
Контрольный раствор № 2.
Применяется в качестве контрольного материала для контроля
качества исследований химического состава и микроскопического
исследования осадка мочи.
Реактивы.
1. Калий фосфорнокислый однозамещенный (КН2РО4), хч, 0,37
ммоль/л.
2. Натрий фосфорнокислый двузамещенный (Nа2НР04 х 7Н20), чда,
0,19 моль/л.
3. Сыворотка крови с нормальным содержанием белка.
4. D(+) - Глюкоза, безводная, ч, чда.
5. Ацетон, ч, чда.
6. Гемолизат. К эритроцитарной массе добавляют равный объем
дистиллированной воды и тщательно перемешивают.
Страницы:
Стр.1 |
Стр.2 |
Стр.3 |
Стр.4 |
Стр.5 |
Стр.6 |
Стр.7 |
Стр.8
|
