Стр. 4
Страницы:
Стр.1 |
Стр.2 |
Стр.3 |
Стр.4 |
Стр.5
сжечь в муфельной печи, а при ее отсутствии утилизировать, как труп
животного.
Приложение 1
к Инструкции по диагностике
губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота
Инструменты, применяемые для вскрытия черепной коробки
***** НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ
Приложение 2
к Инструкции по диагностике
губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота
Схема распилов черепа крупного рогатого скота
***** НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ
Приложение 3
к Инструкции по диагностике
губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота
Схема участков головного мозга животных
***** НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ
Приложение 4
к Инструкции по диагностике
губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота
Схема разрезов головного мозга
***** НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ
Приложение 5
к Инструкции по диагностике
губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота
Аппаратура, материалы и инструменты, используемые для
гистологической обработки и окраски тканей
1. Автомат универсальный (типа АТ-4, АТ-5) для гистологической
обработки и окраски тканей
2. Термостат суховоздушный (на 37°С)
3. Термостат для парафиновой заливки ТВЗ-25 (на 58-60°С)
4. Микротом санный (мс) или для парафиновых срезов (МПС-2)
5. Станок для заточки микротомных ножей
6. Станок для правки микротомных ножей
7. Микротомные ножи (для парафиновых или целлоидиновых срезов)
8. Формалин (коммерческий), параформ
9. Спирт 96° (этанол)
10. Медь сернокислая (5-водная или безводная)
11. Хлороформ
12. Уксусная кислота (ледяная)
13. Гематоксилин (или гематеин)
14. Эозин калия или натрия
15. Соляная кислота
16. Ксилол (пара-, орто-, мета-)
17. Фенол (карболовая кислота)
18. Иглы препаровальные гистологические (стоматологический зонд)
19. Белковый клей
20. Блоки деревянные (или текстолитовые)
21. Плитка электрическая (газовая горелка)
22. Спиртовки
23. Часы песочные на 1, 2, 3, 5, 10 минут
24. Карандаш по стеклу (тушь черная, чернила по стеклу)
25. Бальзам канадский (пихтовый)
26. Предметные и покровные стекла
27. Фильтровальная бумага (фильтры)
Приложение 6
к Инструкции по диагностике
губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота
Приготовление различных концентраций спиртов
для гистологических исследований
---------------------------T----------------------------------------
¦ Необходимое количество компонентов, мл
Для получения 100 мл спирта+------T------T------T------T------T-----
¦96° ¦ воды ¦90° ¦ воды ¦80° ¦ воды
¦спирта¦ ¦спирта¦ ¦спирта¦
---------------------------+------+------+------+------+------+-----
50° 52 48 44 56 50 50
60° 63 37 50 50 56 44
70° 73 27 56 44 63 37
75° 78 22 83 17 94 6
80° 83 17 89 11 - -
90° 94 6 - - - -
--------------------------------------------------------------------
Приложение 7
к Инструкции по диагностике
губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота
Дефекты при изготовлении парафиновых срезов, методы их устранения
--T------------------------T-----------------------T----------------
№ ¦ Дефект ¦ Причина ¦Метод устранения
--+------------------------+-----------------------+----------------
1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4
--+------------------------+-----------------------+----------------
1. Залитый кусочек выпадает 1. Недостаточное Повторная
из парафина при резке обезвоживание материала заливка
2. Неполное удаление материала
промежуточных сред
3. Охлаждение кусочка
при переносе его в
форму
4. Заливка материала
охлажденным парафином
2. Материал плохо режется, 1. Переуплотнение Устранить
нож подскакивает над материала при проводке трудно.
поверхностью блока, и фиксации Поставить
поверхность среза микротомный нож
неровная под углом к
блоку и
попытаться
получить
одиночные срезы
3. Срезы хрупкие, крошатся 1. Твердый парафин Повторно залить
2. Низкая температура материал в более
окружающей среды мягкий парафин
3. Большой угол наклона (или добавить
ножа воск).
Прогревать
дыханием
поверхность
блока перед
каждым движением
ножа или
включить сбоку
настольную
лампу.
Уменьшить угол
наклона ножа
4. Срезы закручиваются, 1. Мягкий парафин Охладить блок в
прилипают к поверхности 2. Высокая температура холодильнике
ножа окружающей среды (2-3 мин).
3. Малый угол наклона Увеличить угол
ножа наклона ножа
5. Срезы раздваиваются или 1. Грязный парафин Повторно залить
покрыты белесоватыми 2. Зазубрины на лезвии в чистый
полосами ножа парафин.
Заточить или
передвинуть нож
6. Срезы получаются через 1. Малый угол наклона Увеличить угол
одно движение ножа ножа наклона ножа
--------------------------------------------------------------------
Приложение 8
к Инструкции по диагностике
губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота
Губкообразная энцефалопатия рогатого скота
***** НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ
Патогномоничная диффузная вакуолизация нейроглии стволовой
части продолговатого мозга (окраска гематоксилинэозином, 300х)
Приложение 9
к Инструкции по диагностике
губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота
Губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота
***** НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ
Патогномоничная диффузная вакуолизация нейроглии стволовой
части продолговатого мозга. Высокая степень поражения
(окраска гематоксилинэозином, 300х)
Приложение 10
к Инструкции по диагностике
губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота
Губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота
***** НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ
Цитокариопикноз и лизис нейронов. Подобные изменения наблюдаются и
при других инфекционных болезнях с поражением центральной нервной
системы (листериоз, болезнь Ауески, злокачественная катаральная
горячка) (окраска гематоксилинэозином, 300х)
Приложение 11
к Инструкции по диагностике
губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота
Нормальные участки коры полушарий головного мозга
***** НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ
Преобладание волокон нейроглии и нейронов
(окраска гематоксилинэозином 300х)
Приложение 12
к Инструкции по диагностике
губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота
Нормальные участки коры полушарий головного мозга
***** НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ
Преобладание волокон нейроглии и нейронов
(окраска серебрением по Кохалю, 300х)
Приложение 13
к Инструкции по диагностике
губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота
Мозжечок здорового животного
***** НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ
Грушевидные клетки Пуркинье, зернистый слой с мелкими нейронами,
молекулярный слой (немиелизированные волокна) нейронов
(окраска серебрением по Кохалю, 300х)
Приложение 14
к Инструкции по диагностике
губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота
Оборудование, реактивы и приготовление растворов для проведения
электронной микроскопии губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота в мазках-отпечатках
Оборудование
1. Электронный микроскоп (JEM-I00 CХ, Япония)
2. Электронно-микроскопические сеточки (Balzera, Union) на 100
или 50 ячеек
3. Иономер (рН-метр)
4. Автоматические пипетки с переменным объемом на 0,02 мл; 1,0
мл
5. Наконечники к автоматическим пипеткам на 0,02 мл; 1,0 мл
6. Бритвенные лезвия "Нева"
7. Лабораторная посуда
8. Весы аналитические
9. Термостат
10. Чашки Петри
11. Фильтровальная бумага
Реактивы
1. Додецилсульфат натрия, (L4509, Sigma)
2. Трипсин (Т8003, Sigma)
3. Протеиназа К (Р5056, Sigma)
4. Трис-(гидрооксиметил)-аминометан (Т1378, Sigma)
5. HСl концентрированная (ГОСТ 3118-77)
6. Натрий хлористый (NaCl) (ГОСТ 4233-77)
7. Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (Е9884, Sigma)
8. Глутаральдегид 25% (G6257, Sigma)
9. Уранил ацетат, Serva
10. Метиловый спирт (метанол) (М3641, Sigma)
Приготовление растворов
Все растворы готовятся на бидистиллированной воде.
1. Фосфатный буфер рН 7,2 (28 мл 0,2 М NаН2РО4 + 72 мл 0,2 М
Nа2НРО4).
2. Буфер STE, рН 7,4 (0,01 М трис-НСl, рН 7,4, 0,1 М NaCl,
0,001 ЭДТА) - взвешивают навески NaCl (1,4625 г), трис-НСl (0,3028
г) и ЭДТА (0,1041 г), растворяют в бидистиллированной воде,
концентрированной НСl, устанавливают рН 7,4 и доводят конечный объем
раствора до 250 мл.
3. 2% додецилсульфат натрия - 2 г ДСН растворяют в
бидистиллированной воде. Объем доводят до 100 мл.
4. Трипсин (5 мг трипсина растворяют в 10 мл фосфатного
буфера).
5. Протеиназа К (2 мг протеиназы К растворяют в 10 мл буфера
STE, рН 7,4).
6. 2,5% глутаральдегид (10 мл 25% глутаральдегида + 90 мл
фосфатного буфера).
7. 5% уранил ацетат (0,5 мл уранил ацетата + 7 мл метанола + 3
мл Н2О).
Приложение 15
к Инструкции по диагностике
губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота
Оборудование, реактивы и приготовление растворов для выявления
прионовых палочек в мазках-отпечатках центральной нервной системы
методом негативного контрастирования при энцефалопатии крупного
рогатого скота
Оборудование
1. Скоростная ультрацентрифуга ("Beckman", Швеция)
2. Микроцентрифуга типа "Eppendorf" (Bio-Rad, США)
3. Электронный микроскоп (JEM-IOO CХ, Япония)
4. Электронно-микроскопические сеточки (Balzera, Union) на 100
или 50 ячеек
5. Иономер (рН-метр)
6. Автоматические пипетки с переменным объемом на 0,02 мл; 1,0
мл
7. Наконечники к автоматическим пипеткам на 0,02 мл; 1,0 мл
8. Гомогенизатор Даунса
9. Бритвенные лезвия "Нева"
10. Лабораторная посуда
11. Весы аналитические
12. Термостат
13. Фильтровальная бумага
Реактивы
1. Лаурил саркозин натрия (L9150, Sigma)
2. Изопропаноловый спирт (изопропанол), (L9516, Sigma)
3. Протеиназа К (Р5056, Sigma)
4. Трис-(гидрооксиметил)-аминометан (Т1378, Sigma)
5. HСl концентрированная (ГОСТ 3118-77)
6. Натрий хлористый (NaCl) (ГОСТ 4233-77)
7. Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (Е9884, Sigma)
8. Глутаральдегид (G6257, Sigma)
9. Уранил ацетат, Serva
10. Метиловый спирт (метанол) (М3641, Sigma)
Приготовление растворов
Все растворы готовятся на бидистиллированной воде.
1. Буфер STE, рН 7,4 (0,01 М трис-НСl, рН 7,4, 0,1 М NaCl,
0,001 ЭДТА) - взвешивают навески NaCl (1,4625 г), трис-НСl (0,3028
г) и ЭДТА (0,1041 г), растворяют в бидистиллированной воде,
концентрированной НСl, устанавливают рН 7,4 и доводят конечный объем
раствора до 250 мл.
2. Раствор 1 (10 г лаурил саркозина натрия растворяют в буфере
STE рН 7,4, объем доводят до 100 мл).
3. Раствор 2 (1 г лаурил саркозина натрия и 10 г NaCl
растворяют в буфере STE рН 7,4, объем доводят до 100 мл).
4. Протеиназа К (2 мг протеиназы К растворяют в 10 мл буфера
STE, рН 7,4).
5. 2,5% глутаральдегид (10 мл 25% глутаральдегида + 90 мл
фосфатного буфера).
6. 5% уранил ацетат (0,5 мл уранил ацетата + 7 мл метанола + 3
мл Н2О).
Приложение 16
к Инструкции по диагностике
губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота
Оборудование, реактивы и приготовление растворов для диагностики
губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота методом
ультратонких срезов
Оборудование
1. Электронный микроскоп (JEM-IOO CХ, Япония)
2. Ультрамикротом (Reichert, Австрия)
3. Прибор для приготовления стеклянных ножей (Inifemaker,
Австрия)
4. Желатиновые или полистирольные капсулы (желатиновые - РФ,
полистирольные - Beem, США)
5. Электронномикроскопические сеточки (Balzera, Union) на 100
или 50 ячеек
6. Иономер (рН-метр)
7. Автоматические пипетки с переменным объемом на 0,02 мл; 1,0
мл
8. Наконечники к автоматическим пипеткам на 0,02 мл; 1,0 мл
9. Бритвенные лезвия "Нева"
10. Бинокулярная лупа МБС-9, РФ
11. Лабораторная посуда
12. Весы аналитические
13. Термостат
Реактивы
1. Этиловый спирт (этанол) (ГОСТ 18300-87)
2. Метиловый спирт (метанол) (М3641, Sigma)
3. Глутаральдегид (G6257, Sigma)
4. Ацетон (ГОСТ 2603-79)
5. Аралдит (964), Serva
6. Аралдит (212), Serva
7. Арендит 0,64 - катализатор, Serva;
8. Дибутилдифтолат - пластификатор, Serva;
9. Уранил ацетат, Serva
10. Цитрат свинца, Serva
11. Тотрат калия, Serva
12. Едкий натр (NаОН) (ГОСТ 4328-77)
13. Натрий фосфорнокислый (NаНРО4 и Nа2НРО4 х 2Н20) (ГОСТ
4172-76)
14. Тетраоксид осмия ОsО4 (О5500, Sigma)
Приготовление растворов
Все растворы готовятся на бидистиллированной воде.
1. 70% этанол (100 мл 96° этанола + 28 мл Н2О).
2. 100% этанол хранится в посуде с селикогелем или получают из
96° этанола путем обезвоживания (100 мл 96° этанола + 20 г СuSО4 х
5Н2О, прожженого при 100°С в течение 30-40 мин).
3. 2,5% глутаральдегид (10 мл 25% глутаральдегида + 90 мл
фосфатного буфера).
4. Смесь аралдитов. Равные объемы (20 мл) аралдита 964 и
аралдита 212 тщательно перемешивают, предварительно нагрев до 60°,
добавляют 0,8 мл аралдита 964 и 1,2 мл дибутилфтолата и вновь
тщательно перемешивают в течение 20-30 минут.
5. 5% уранил ацетат (0,5 мл уранил ацетата + 7 мл метанола + 3
мл Н2О).
6. Раствор цитрата свинца (40 мг NаОН растворить в 10 мл Н2О+20
мл тортрата калия + 40 мг цитрата свинца).
7. 1% тетраоксид осмия (1,3 г тетраоксида осмия растворить в 50
мл Н2О и хранить в темном месте). Перед употреблением добавить 50 мл
фосфатного буфера.
8. Фосфатный буфер рН 7,2 (28 мл 0,2 М NаН2РО4 + 72 мл 0,2 М
Nа2НРО4).
Приложение 17
к Инструкции по диагностике
губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота
Оборудование, реактивы и приготовление растворов для диагностики
губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота методом
иммуноблотинга
Оборудование
1. Автоматические пипетки с переменным объемом на 1 мл, 0,2 мл
и 0,02 мл
2. Наконечники к пипеткам 1 мл и 0,2 мл
3. Пластиковые центрифужки одноразового применения на 1,5 мл
4. Центрифуга настольная типа ОПН-8
5. Центрифуга лабораторная типа ЦЛР
6. Холодильник бытовой с морозильной камерой -18°С
("Минск-15")
7. Лабораторная посуда
8. рН-метр
9. Источник тока (ПЭФ-3, УИП-2)
10. Прибор для вертикального электрофореза
11. Герметичные коробки для фиксации и окраски гелей
12. Прибор для переноса белков с ДСН-ПААГ на нитроцеллюлозные
мембраны
13. Герметичные коробки для обработки нитроцеллюлозных мембран
14. Целлофановая пленка
15. Фильтровальная бумага
16. Термостат
17. Водяная баня
18. Весы технические 10-200 г
19. Весы аналитические
20. Аппарат для встряхивания АВЧ-6С (РФ)
Реактивы
1. Трис-(гидрооксиметил)-аминометан (ТУ 6-09-4292-76)
2. HСl концентрированная (ГОСТ 3118-77)
3. Глицин (ГОСТ 5860-75)
4. Акриламид (ТУ 6-09-14-1576-73)
5. Метиленбисакриламид (ТУ 6-09-10-1234-77)
6. Додецилсульфат натрия (ТУ 6-09-06-805-76)
7. Аммония персульфат (ГОСТ 20478-75)
8. TEMED (N,N,N,N-тетраметилэтилендиамин) (T9281, Sigma)
9. Бромфеноловый синий (ТУ11П-282-71; ТУ 6-09-4530-77)
10. В-меркаптоэтанол (ТУ 6-09-08-1024-75)
11. Глицерин (ГОСТ 6259-75)
12. Мочевина (ГОСТ 6691-77)
13. Этиловый спирт C2H5OH, (ГОСТ 18300-87)
14. Уксусная кислота ледяная (ГОСТ 61-75)
15. Глицерин (ГОСТ 6259-75)
16. Амидо черный 10В (N3393, Sigma)
17. Мембрана нитроцеллюлозная "Миллипор"-НА (Франция,
"Schleiсher & Schuell" ВАД-0,45 мкм; ФРГ, ВА-85-0,45 мкм)
18. Твин-20 (P7949, Sigma)
19. Бычий сывороточный альбумин (A2153, Sigma)
20. 3,3'-диаминобензидин тетрагидрохлорид (D7304, Sigma)
21. Моноклональные антитела к иммуноглобулинам крупного
рогатого скота, меченные пероксидазой хрена
22. Положительные и отрицательные контрольные сыворотки
Приготовление растворов
Все растворы готовят на бидистиллированной воде.
1. Раствор мономеров: 45 г акриламида; 1,2 г
N,N-метиленбисакриламида и 0,15 г ДСН растворяют в 105 мл Н2О,
фильтруют.
2. Буфер для разделительного геля; 13,6 г трис, 0,2 г ДСН
растворяют в 180 мл Н2О, доводят концентрированной НСl до рН 8,8,
объем доводят H2О до 200 мл.
3. Буфер для фокусирующего геля: 1,68 г трис, 0,1 г ДСН
растворяют в 90 мл Н2О, доводят концентрированной HСl до рН 6,8
(осторожно) и доводят H2О до 100 мл.
4. Электродный буфер, 10-кратный: 144 г глицина, 10 г ДСН
растворяют в 900 мл Н2О, доводят сухим трисом (10 г) до рН 8,3 и
Страницы:
Стр.1 |
Стр.2 |
Стр.3 |
Стр.4 |
Стр.5
|
