Стр. 2
Страницы:
Стр.1 |
Стр.2 |
Стр.3 |
Стр.4 |
Стр.5
вакуоли.
8. Характерные изменения отмечаются при гистологическом
исследовании. При этом выявляются двусторонние симметричные
дегенеративные изменения в некоторых участках серого вещества ствола
головного мозга. В нейропиле отмечается умеренное количество
дискретно овоидных вакуолей или микрополостей. Нейрональные
перикарионы и асконы ядер ствола мозга содержат крупные, хорошо
ограниченные внутрицитоплазматические вакуоли, которые бывают
единичными или множественными, иногда явно растягивая сому клеток,
образуя нейроны с узкой полоской цитоплазмы. Содержимое вакуолей не
окрашивается и остается прозрачным при окраске на гликоген в
парафиновых срезах и на липиды в криосрезах. Сходные изменения
отмечаются при скрепи овец, болезни Крейнцфельдта-Якоба человека и
других губкообразных энцефалопатиях человека и животных.
Глава 4. Эпизоотологические особенности
губкообразной энцефалопатии крупного рогатого скота
9. Причиной возникновения эпизоотии губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота явилась мясо-костная мука, содержащая белки
больных жвачных животных. Имеется риск для телят, родившихся от
больных коров в течение 3 лет после прекращения скармливания
мясо-костной муки.
10. Чувствительность к заражению животных губкообразной
энцефалопатией в значительной степени зависит от индивидуальной
предрасположенности к возбудителю. Вероятность заболевания теленка,
родившегося от пораженной коровы, намного выше, чем у теленка,
родившегося от здоровой коровы. Из-за длительного инкубационного
периода сложилась такая ситуация, при которой находившийся в кормах
возбудитель мог в течение 3-8 лет инфицировать восприимчивую
субпопуляцию крупного рогатого скота, вызывая губкообразную
энцефалопатию без проявления клинических признаков.
Глава 5. Диагностика губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота
11. Установление диагноза на губкообразную энцефалопатию
крупного рогатого скота включает:
11.1. изучение клинических признаков;
11.2. изучение эпизоотологической ситуации;
11.3. проведение патогистологических исследований;
11.4. проведение электронно-микроскопического исследования;
11.5. проведение иммунохимических исследований
(иммуноблотинг);
11.6. проведение биопробы на лабораторных животных.
12. Для диагностических исследований в специализированную
лабораторию по изучению губкообразной энцефалопатии крупного
рогатого скота посылают:
мозг крупного рогатого скота после исследования на бешенство,
другие вирусные инфекции и отравления после неподтверждения
диагноза;
мозг крупного рогатого скота из мясокомбинатов (0,01% от
забитых животных старше 3 лет).
Глава 6. Порядок отбора проб мозга для
диагностических исследований
13. Диагностика губкообразной энцефалопатии крупного рогатого
скота проводится только после гибели или вынужденного убоя животных.
В этой связи важным условием являются правильный отбор проб, их
фиксация, транспортировка и хранение.
14. Патологический материал (головной мозг) берут от животных с
клиническими признаками поражения центральной нервной системы. При
этом головной мозг для гистологических, электронно-микроскопических
и иммунохимических исследований необходимо брать у животных сразу
после их убоя или гибели до наступления лизиса тканей или
размножения другой сопутствующей микрофлоры.
15. Для извлечения мозга у крупного рогатого скота необходим
инструментарий согласно приложению 1.
16. Животных с клиническими признаками губкообразной
энцефалопатии умерщвляют различными способами: введением избыточной
дозы барбитурата - раствором барбамила (2-3 г на 15-20 мл воды),
внутримышечным введением раствора гемоспоридина (1-2 г на 15-20 мл
воды), 20-30 мл 25-процентного раствора сернокислой магнезии
транстаракально в области сердца.
17. Голову отделяют от шеи по атланто-затылочному сочленению.
Труп животного сбрасывают в забетонированную яму Беккари глубиной не
менее 3 метров и засыпают хлорной известью. Наиболее эффективным
способом утилизации трупов является их сжигание. Отделенную от трупа
голову упаковывают в металлическую пленку, помещают в металлический
контейнер, желательно со льдом, транспортируют при температуре
+2-15°С в ветеринарную лабораторию или специализированную
лабораторию по изучению губкообразной энцефалопатии крупного
рогатого скота.
18. Голова должна быть доставлена в исследовательскую
лабораторию в течение 12-36 часов, поскольку в результате
размножения микроорганизмов в тканях мозга или автолиза мозг
становится непригодным для гистологического исследования.
Замороженный при транспортировке или при хранении в холодильнике
головной мозг также непригоден для проведения анализа, так как в
результате замораживания возникают артефакты, мешающие диагностике.
При длительной транспортировке или в жаркую погоду целесообразно в
контейнер положить лед.
19. Сразу после доставки в исследовательскую лабораторию с
дорсальной части головы крупного рогатого скота удаляют кожу.
Имеется два способа извлечения головного мозга из черепной коробки.
При первом способе голову зажимают в тиски, а при втором -
проводят ручную фиксацию на столе на листе бумаги, который кладется
для предотвращения скольжения.
После фиксации осторожно, чтобы не повредить мозг, согласно
приложению 2 распиливают лобную кость с помощью анатомической пилы
(разрез 1). Затем производят надрезы лобной кости с каждой стороны
от точек, находящихся на оси глазных ям, продлевая их каудально до
наружных слуховых проходов. Продлевают эти разрезы каудально до
большого затылочного отверстия также осторожно, чтобы исключить
повреждение мозга (разрез 2). Делают сагитальный разрез посредине
лобной и затылочной костей до большого затылочного отверстия (разрез
3). Затем разделяют и удаляют распиленные левую и правую части
черепной коробки. Рассекают и снимают твердую мозговую оболочку.
Затем необходимо перевернуть голову, чтобы под действием силы
тяжести мозг отделился от основания черепа. Продолжить работу,
продвигаясь от каудального надреза вперед; для перерезания нервов
вентральной стороны черепа использовать скальпель. После извлечения
мозга фиксацию проводят путем несплошных разрезов мозга на пластины
или мозг целиком помещают в фиксирующий раствор следующего состава:
однозамещенный фосфат натрия, моногидрат (NaH2PO4 х H2O) - 4,0 г;
двузамещенный фосфат натрия, безводный (Na2HPO4) - 6,5 г; формалин
(40% НСНО) - 100,0 мл; дистиллированная вода - 900,0 мл. После
растворения солей в воде добавляют формалин и размешивают, при этом
рН раствора должен быть нейтральным, около 7,0.
20. Фиксацию мозга осуществляют следующим образом.
Учитывая особенность проявления губкообразной энцефалопатии
(отечность и расплавление нейроглии), фиксация мозга должна быть
экстренная и жесткая, позволяющая исключить артрефакты и обеспечить
максимально достоверную диагностику.
20.1. Для фиксации головного мозга путем использования
несплошных поперечных разрезов на извлеченном головном мозге
необходимо сделать несплошные поперечные разрезы в виде пластин
толщиной 5-8 мм (схема участков головного мозга и его разрезов
согласно приложениям 3 и 4). Более толстые пластины делать нельзя,
так как формалин проникает и фиксирует ткани только на толщину не
более 8 мм. Между пластинами ткани проложить гигроскопический
материал (вату, марлю, фильтровальную бумагу).
Для фиксации головного мозга, разрезанного на продольные
полосы, рекомендуется использовать 15-20-процентный раствор
нейтрального формалина (150-200 мл формалина и 800-850 мл воды,
параформа - соответственно в 2,5 раза меньше). Срок фиксации - 3-4
суток. Также можно проводить фиксацию мозга в растворе,
предусмотренном пунктом 18 настоящей Инструкции.
20.2. Для фиксации головного мозга его целиком помещают в
фиксирующий раствор в соответствии с пунктом 19 настоящей
Инструкции.
20.3. Зафиксированный мозг помещают в ударопрочную емкость, при
этом объем фиксирующего раствора должен быть в 10 раз больше объема
мозга. В таком виде материал должен храниться не менее 2 недель,
после чего его необходимо доставить в лабораторию вирусных и
прионных инфекций крупного рогатого скота Республиканского
унитарного предприятия "Белорусский научно-исследовательский
институт экспериментальной ветеринарии им.С.Н.Вышелесского".
Глава 7. Патогистологическая диагностика
21. Сущность метода заключается в микроскопическом определении
степени выраженности и характера изменений в головном мозге
животных, пораженных губкообразной энцефалопатией крупного рогатого
скота.
22. Аппаратура, материалы и инструменты, используемые для
гистологической обработки и окраски тканей, - согласно приложению
5.
23. Патологогистологическую обработку материала проводят в
следующей последовательности.
23.1. Взятие материала. Взятие материала от животных производят
из фиксированного мозга в соответствии с пунктами 18 и 19 настоящей
Инструкции. Вырезают кусочки зафиксированных тканей мозга в виде
пластинок не толще 0,5-1 см из различных участков органа.
23.2. Фиксация материала. Патологический материал обязательно
должен быть этикетирован и зафиксирован немедленно и непосредственно
после взятия (но не позднее 12 часов). Категорически запрещается
патологический материал замораживать.
23.3. Уплотнение материала. Уплотнение материала проводят при
помощи прозрачных сред (целлоидина, парафина).
Уплотнение материала проводят в основном путем заливки в
прозрачные среды (парафин, целлоидин). Для заливки материала в
парафин необходимы: спирты (50, 60, 70, 80, 90, 100°),
100°-й хлороформ, хлороформ, хлороформ-парафин и парафин (2-3
порции).
Разведение спиртов проводят согласно приложению 6 к настоящей
Инструкции.
Абсолютный (100°) спирт приготавливают путем добавления к 96°
спирту безводного медного купороса (порошок серовато-белого цвета).
Применяя для этой цели кристаллический медный купорос
(CuSO4 х 5H2O), его необходимо предварительно обезводить путем
медленного прокаливания (на электроплитке, газе). Этот процесс ведут
в фарфоровой ступке при постоянном помешивании во избежание
образования трудно разбиваемых комков фарфоровой и стеклянной
палочкой - нельзя металлической или пластмассовой. Прокаливание
длится 2-3 часа до получения порошка белого цвета, но не серого.
Прокаленный купорос гигроскопичен, поэтому его хранят в банке или
склянке с притертой пробкой. После охлаждения он пригоден к работе.
Процесс прокаливания медного купороса нужно вести в вытяжном
шкафу, а при отсутствии последнего пользоваться ватно-марлевыми
повязками.
В банку или склянку наливают необходимое количество спирта,
затем добавляют обезвоженный медный купорос из расчета 10-15
процентов к объему спирта в течение 1-2 суток, периодически
энергично встряхивают. Белый цвет порошка переходит в голубой
вследствие поглощения купоросом воды. Этот процесс повторяют
несколько раз до тех пор, пока после внесения спирта порошок не
приобретет синее окрашивание, каждый раз сливая спирт в чистую
посуду. Готовый абсолютный спирт переливают в чистую сухую емкость,
после чего он годен к работе.
Парафин поступает, как правило, гомогенизированный. Для
придания ему пластичности в расплавленный парафин рекомендуется
добавлять пчелиный воск до 5 процентов, что облегчает получение
качественных и тонких срезов.
Кусочки мозга толщиной 0,5 см выдерживают в каждом из реагентов
по 3-4 часа, при использовании автомата для гистологической
обработки тканей типа АТ-4 или АТ-5; затем в хлороформ-парафине 2-3
часа при температуре 37°С; парафине I и II по 45-60 минут при
температуре 58-60°С. После этого заливают в формочки (чашки Петри)
новую порцию парафина и помещают в него кусочки.
После появления достаточно плотной пленки застывшего парафина
формочки с кусочками мозга погружают в емкость с холодной водой для
равномерного охлаждения и уплотнения.
Не рекомендуется ставить формочки в холодильник, так как при
очень быстром охлаждении нарушается структура парафина, который
получается крошковатым и плотным. При соблюдении приведенных условий
парафин после заливки представляет однородную массу. Наличие пузырей
воздуха, молочно-белых зернистых участков свидетельствует о
недостаточном удалении промежуточных сред или неравномерном
охлаждении. Если проведено неудовлетворительное обезвоживание или
заливка охлажденным парафином и кусочки материала будут вылущиваться
из парафина, необходимо освободить кусочки от парафина и залить их
вторично (начиная со спирт-хлороформа).
При отсутствии аппаратов АТ-4 или АТ-5 применяется сокращенная
схема заливки - спирт 50°, 75°, 96°, 100° и так далее с экспозицией
в каждом по 6-12 часов, что приводит к удлинению срока обработки до
3-5 суток.
В последующем вырезают прямоугольные блоки, оставляя вокруг
кусочка слой парафина шириной 1-1,5 мм. Для наклеивания блоки кладут
на деревянный кубик и вдвигают между ними горячий шпатель.
Дополнительно оплавляют по краям этим же шпателем. Блоки должны
соответствовать колодкам и не выступать за их края. Деревянные
кубики готовят из твердых пород дерева (березы, бука), можно из
паркетных дощечек.
Достоинством метода заливки в парафин является относительная
быстрота, возможность изготовления тонких (2-3 мкм) серийных срезов,
а недостатком - некоторое уменьшение объема материала и
необходимость воздействия на материал относительно высокой
температуры.
Метод заливки патологического материала в целлоидин из-за его
дефицита, длительности и трудоемкости в практических условиях
используется редко.
23.4. Изготовление срезов (микротомирование):
При изготовлении срезов следует правильно использовать
микротомные ножи, которые выпускают трех марок: "а" - из мягкой
стали для целлоидиновых блоков (плосковогнутые), "б" - из более
твердой стали для резки целлоидиновых и парафиновых блоков (имеет
форму прямоугольного треугольника), "в" - из самой твердой стали для
изготовления парафиновых и замороженных срезов (форма
равнобедренного треугольника).
Марка стали обычно указывается на обутке ножа.
23.5. Парафиновые срезы готовят следующим образом:
23.5.1. парафиновый блок (на колодке) зажимают в
объектодержатель микротома перпендикулярно к ножу;
23.5.2. при помощи рукояток переместить рамки объектодержателя
так, чтобы поверхность блока была горизонтальной ножу;
23.5.3. укрепить микротомный нож в поперечном положении, чтобы
нож и края блока были параллельны;
23.5.4. установить микровинт на деление 20-30 микрон, подвести
блок до легкого соприкосновения с ножом и закрепить, произвести
грубую зачистку блока, чтобы обнаружилась ткань кусочка, краем ножа;
23.5.5. объектодержатель слегка сдвинуть, поставить нож ближе к
середине;
23.5.6. подвести объектодержатель с блоком до легкого
соприкосновения с ножом, закрепить его;
23.5.7. изготовить гистосрез.
Качество срезов зависит от величины и плотности объекта,
твердости парафина, окружающей температуры и других факторов.
Поэтому в одних случаях срезы получаются при быстром толчкообразном,
в других, наоборот, при медленном и равномерном движении ножа. При
изготовлении парафиновых срезов возможны дефекты согласно приложению
7 к настоящей Инструкции;
23.5.8. полученные срезы при помощи мягкой кисточки (слегка
смоченной водой) или препаровальной иглы снимают с ножа и переносят
на планшет или гладкую бумагу (лучше черную). Срезы подписывают с
указанием объекта, с которого получены срезы, или напротив среза
располагают соответствующий блок, с которого он сделан.
Перед расправлением срезов предварительно на обезжиренные
предметные стекла наносят белковый клей, предназначенный для
прикрепления их к стеклам;
23.5.9. для приготовления клея используют свежий яичный белок
без примесей. 2 части белка взбивают тщательно вилкой до состояния
пены, добавляют 1 часть глицерина, 1 кристаллик камфоры или тимола и
размешивают. Смесь готова к использованию через 1-2 дня. На
предметное стекло наносят маленькую каплю клея, растирают пальцем
досуха и проносят над пламенем спиртовки 3-5 раз, пока не исчезнет
помутнение на стекле.
Для расправления срезы переносят в емкость (чашку, бобовидный
тазик) с теплой (46-48°С) дистиллированной водой, температуру
контролируют термометром и расправляют. Более горячая вода приводит
к расплавлению парафина. Лучше использовать спирт 70°С. Срезы кладут
на воду или спирт той стороной, которая была обращена к ножу;
23.5.10. характер расправления серийных срезов несколько иной.
Серию срезов вначале плавно подносят к краю емкости, затем несколько
ускоренным движением вперед касаются воды нижним краем и при таком
же движении вдоль краев чашки опускают на воду поочередно следующие
срезы. Подготовленное ранее предметное стекло опускают концом в
воду, подводят под срезы и подхватывают их препаровальной иглой за
один из краев, затем плавно вынимают из воды стекло вместе со
срезом. Остатки воды вокруг среза удаляют фильтровальной бумагой,
ставят стекла вертикально в подставки и оставляют для сушки на
несколько часов при комнатной температуре во избежание отклеивания
их во время окраски. Допускается при небольшом количестве
патологического материала изготовление замороженных срезов.
23.6. Окрашивание гистосрезов проводят в следующей
последовательности:
23.6.1. окрашивание проводится с целью оптической
дифференцировки структурных элементов тканей. Используемые в
гистологической технике краски делятся: на основные (ядерные, кислые
(цитоплазматические, фоновые), нейтральные и специальные.
Из группы основных красок наибольшее применение имеют
приготовленные из гематоксилина. Наиболее употребительными являются
гематоксилин Эрлиха и гематоксилин Бемера;
23.6.2. гематоксилин Эрлиха состоит: из гематоксилина - 2 г,
спирта 96° - 100 мл, воды дистиллированной - 100 мл, глицерина - 100
мл, квасцов алюмокалиевых - 3 г и кислоты уксусной ледяной - 10 мл.
Приготовленный раствор гематоксилина Эрлиха наливают в широкогорлую
банку, завязывают марлей 3-4 слоя и оставляют на свету для
созревания на 3-4 недели, периодически взбалтывая. Созреваемая
краска имеет темно-вишневый цвет, приятный запах, оставляет след на
стекле. Такой раствор фильтруют и хранят в плотно закрытой посуде.
Срезы окрашивают в течение 3-5 минут;
23.6.3. гематоксилин Бемера готовят следующим образом: 40 г
алюмокалиевых квасцов растворяют в 400 мл дистиллированной воды при
нагревании, охлаждают и фильтруют в широкий стакан, затем добавляют
20 мл 10%-го спиртового раствора гематоксилина (на 96°-м спирте),
завязывают марлей и оставляют для созревания, как и гематоксилин
Эрлиха.
При приготовлении гематоксилинов все компоненты добавляют в
указанной последовательности после растворения предыдущего реактива.
Перед каждым употреблением гематоксилин необходимо фильтровать во
избежание выпадения осадков в срезах;
23.6.4. из кислых красок постоянное применение имеет эозин К
(калий) или Н (натрий) в 0,25-0,5-процентных водных растворах.
Концентрацию рабочего раствора определяют опытным путем. Для этого
окрашивают несколько срезов в различных растворах краски (0,1; 0,2;
0,3% и так далее) в течение 2-5 минут, проверяют под микроскопом
степень окрашивания и устанавливают оптимальную концентрацию.
Все краски для гистологических работ готовят только на
дистиллированной воде.
23.7. Окраска срезов гематоксилин-эозином.
23.7.1. Этот метод позволяет определить не только наличие
патологических изменений, но и ориентировать на необходимость
применения других дополнительных методов для окончательного
установления диагноза (например, по Ван-Гизону - на соединительную
ткань, ретикулиновых волокон - по Футу, липидов - Суданом).
23.7.2. Окраску гистосрезов проводят в следующем порядке:
депарафинирование (ксилол - 3 порции, спирт 100°, 96°, 70°,
вода дистиллированная - 2 порции) по 2 минуты в каждом растворе;
промывка в водопроводной воде 60-90 секунд;
дифференцировка в солянокислом спирте (1-процентный раствор
соляной кислоты в 70°-м спирте) до появления розового цвета срезов
(30-60 секунд);
промывка в водопроводной воде (лучше в двух порциях) 3-5-10
минут до посинения срезов;
окраска раствором эозина - 2-5 минут;
промывка в дистиллированной воде 40-60 секунд;
обезвоживание в спиртах возрастающей крепости (70°, 96°, 100°)
по 1 минуте;
просветление гистосрезов в карбол-ксилоле 2 минуты;
окрашенные гистосрезы переносят в ксилол на 1-2 минуту, после
чего заключают в бальзам.
Для просветления срезов используют карбол-ксилол в соотношении
1:4-1:10 (по объему). Для этого расплавляют в термостате (при
56-60°) кристаллическую карболовую кислоту (фенол) и смешивают с
ксилолом, который также предварительно ставят в термостат.
23.8. Для заключения срезов под покровное стекло чаще
применяется канадский или пихтовый бальзам;
23.8.1. затвердевшую смолу помещают в широкогорлую банку,
заливают ксилолом (5:1) и ставят в термостат при 37°С. Бальзам
должен иметь консистенцию жидкого мела. Кедровый бальзам - низкого
качества, так как быстро кристаллизуется под покровным стеклом и
гистопрепараты невозможно долго хранить;
23.8.2. при заключении срезов каплю бальзама наносят на
предметное стекло под углом 45°С и, когда бальзам растечется по
краю, плавно его опускают на срез, поддерживая противоположный край
иглой. Излишки бальзама удаляют со стекла салфеткой или тряпочкой,
слегка смоченной ксилолом. Препарат кладут на планшет горизонтально
на 24-48 часов, желательно под груз. Стекла этикетируют. Подписи
делают тушью или чернилом по стеклу. При этом методе окраски ядра
клеток лиловые или синие, цитоплазма - красного цвета различного
тона, соединительная ткань - светло-розового цвета.
24. Характерные (патогномоничные) для губкообразной
энцефалопатии крупного рогатого скота признаки согласно приложениям
8-10:
- диффузная вакуолизация и расплавление нейроглии (в виде
множественных разной формы и величины сот);
- коагуляция цитоплазмы в нейронах, проявляющаяся в виде
плотного сгустка с повышенной оксифильностью (красного цвета);
- наличие пикноза, рексиса и частичного лизиса ядер нейронов,
иногда криброза цитоплазмы (множественные мелкие вакуоли);
- гипертрофия эндотелия кровеносных сосудов с явлениями
кариопикноза и репсиса);
- наличие периваскулярных круглоклеточных астроцитных и
макрофагальных элементов типа негнойного энцефалита (напоминающие
"висна" у овец);
- явления вакуолизации нейронов (перстневидные клетки)
встречаются редко и слабо выражены, тогда как при "скрепи" у овец
они носят более выраженный характер;
- наличие вокруг нейронов явлений отека и вакуолизации;
24.1. подтвержденным на губкообразную энцефалопатию крупного
рогатого скота диагноз следует считать только на основании
комплексного анализа эпизоотологических, клинико-анатомических и
патогистологических исследований. При этом следует сравнивать
гистопрепараты отделов головного мозга, полученных от заведомо
здоровых животных (контроль);
24.2. сомнительным считается диагноз при наличии ассиметричных
признаков вакуолизации в нейроглии или в нейронном околоядерном
пространстве;
24.3. отрицательный диагноз ставится в случае отсутствия
гистологических изменений в основных участках головного мозга,
необходимых для диагностики, согласно приложениям 11-13), а при
подозрении и остальных участков мозга;
24.4. Дополнительными методами диагностики губкообразной
энцефалопатии являются электронно-микроскопический метод,
иммуноблотинг, а также иммуногистохимический метод выявления
патологических PrP-белков в обычных, фиксированных в формалине
срезах, который проводится Всероссийским научно-исследовательским
институтом защиты животных (г.Владимир, Российская Федерация).
Глава 8. Электронно-микроскопический метод исследований
25. Выявление (САФ) в тканях центральной нервной системы (далее
- ЦНС) методом получения мазков-отпечатков осуществляется путем их
изучения после воздействия на мазок различных ферментов и
дальнейшего их просмотра под электронным микроскопом.
25.1. Исследования проводят в следующем порядке:
приготовление исходных концентрированных и рабочих растворов;
получение мазков-отпечатков;
обработка исследуемых проб;
контрастирование;
микроскопия;
учет результатов.
25.2. Оборудование, реактивы и приготовление растворов -
согласно приложению 14.
25.3. Постановка реакции проводится в следующем порядке:
25.3.1. в исследуемой ткани мозга (лобная, височная,
затылочная, теменная части коры полушарий большого мозга, кора
мозжечка) делают срез длиной не менее 1 см;
25.3.2. электронно-микроскопические сеточки, покрытые
фармваруглеродной подложкой, предварительно смоченные в
бидистиллированной воде и/или 2-процентном растворе додецилсульфата
натрия (далее - ДСН) в течение 1 минуты, помещаются на "свежий" срез
мозга на 1 минуту;
25.3.3. в 3 чашки Петри вносят по 200 мкл растворов ДСН,
трипсина и протеиназы К соответственно. Полученные на сеточках
мазки-отпечатки накладывают отпечатком вниз в капли соответствующих
растворов, накрывают крышкой, помещают в термостат и инкубируют в
течение 30 минут при 37°С;
25.3.4. для каждого вида обработки используют по 4
электронно-микроскопические сеточки. Отдельные сеточки проводят
последовательно через обработку всеми тремя реагентами;
25.3.5. после обработки сеточки промывают дистиллированной
водой (5 раз по 30 секунд);
25.3.6. для контрастирования сеточки с мазками-отпечатками
помещают в 5-процентный раствор уранил ацетата на 15-20 минут, затем
интенсивно промывают под проточной дистиллированной водой и
высушивают на фильтровальной бумаге;
25.3.7. исследование мазков-отпечатков проводят на электронном
микроскопе при ускоряющем напряжении 80 кВ и инструментальном
увеличении 15000-60000;
25.3.8. учет результатов проводят путем сравнительного
электронно-микроскопического изучения мазков-отпечатков мозга в
сочетании с обработкой ДСН, трипсином и протеиназой К, что позволяет
идентифицировать САФ из общего пула трубчато-филаментозных
образований, выявляемых в ЦНС. При этом, чем более выражена
"жесткость" ферментативной обработки, тем ниже вероятность ошибки и
выше возможность обнаружения таких специфических фибриллярных
структур.
После описанной обработки при электронно-микроскопическом
обследовании сеточек в мазках-отпечатках сохраняются только
аномальные филаментозные спиральные структуры - САФ, устойчивые к
воздействиям, модифицирующим белковые макромолекулы. Обычно САФ
представлены относительно однородной по морфологии популяцией: имеют
диаметр 10-20 нм и состоят из нескольких (2-4) спирально закрученных
протофиламентов, перекрещивающихся друг с другом через одинаковые
интервалы 50-150 нм. Длина САФ может варьировать в зависимости от
"жесткости" ферментативной обработки в пределах от 100-200 нм до
1,5-2 микрон. Реже PrP-структуры могут быть представлены отдельно
лежащими глобулами, палочками и/или другими палочковидными
структурами. Обнаружение протеазо-устойчивых структур
свидетельствует о наличии прионовой инфекции в ЦНС.
26. Выявление прионовых палочек в тканях центральной нервной
системы методом негативного контрастирования осуществляют путем их
ферментативного выделения с последующим просмотром под электронным
микроскопом.
26.1. Исследование проводят в следующем порядке:
приготовление исходных концентрированных и рабочих растворов;
обработка исследуемых проб (выделение и очистка белковых
структур);
Страницы:
Стр.1 |
Стр.2 |
Стр.3 |
Стр.4 |
Стр.5
|
