Стр. 3
Страницы: | Стр.1 | Стр.2 | Стр.3 | Стр.4 |
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦1 ¦Микроскоп бинокулярный с иммерсионным объективом ¦ 1 ¦
¦ ¦(x 100), окулярами (x 7 и x 10) (Микмед - вариант 2,¦ ¦
¦ ¦производство ЛОМО, С-Петербург) ¦ ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦2 ¦Спиртовка с марлевым фитилем или с металлической ¦ 1 ¦
¦ ¦нитью ¦ ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦3 ¦Флаконы для сбора мокроты с широким горлышком и ¦5000 ¦
¦ ¦завинчивающейся крышкой или пластмассовые, ¦ ¦
¦ ¦одноразовые, 45 - 50 мл ¦ ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦4 ¦Лотки эмалированные, 30 x 50 см ¦ 4 ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦5 ¦Предметные стекла 25 мм x 75 мм, толщиной ¦5000 ¦
¦ ¦1,1 - 1,3 мм ¦ ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦6 ¦Емкость стеклянная для хранения стекол ¦ 1 ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦7 ¦Часы песочные (5 мин.) ¦ 1 ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦8 ¦Бактериологическая петля ¦ 2 ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦9 ¦Вата белая гигроскопическая ¦ 500 г ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦10 ¦Деревянные аппликаторы или никелево-хромовая ¦ 5000 ¦
¦ ¦проволока диаметром 1 мм ¦ 50 см ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦11 ¦Дозатор растворов стеклянный емкостью 10 мл ¦ 2 ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦12 ¦Штатив для предметных стекол, вмещающий 12 - 25 ¦ 1 ¦
¦ ¦стекол ¦ ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦13 ¦Коробка для хранения стекол, пластмассовая или ¦ 20 ¦
¦ ¦металлическая, на 12 - 25 стекол ¦ ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦14 ¦Мостик или лоток для окрашивания мазков ¦ 1 ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦15 ¦Флаконы стеклянные из коричневого стекла, емкостью ¦ 3 ¦
¦ ¦100 мл, 500 мл (для фуксина с притертой пробкой) ¦ ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦16 ¦Мерный цилиндр, стеклянный, емкостью 100 мл ¦ 1 ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦17 ¦Термостойкая мерная колба, стеклянная, емкостью ¦ 2 ¦
¦ ¦1000 мл ¦ ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦18 ¦Ножницы из нержавеющей стали, 25 см ¦ 1 ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦19 ¦Пинцет из нержавеющей стали (15 см) ¦ 2 ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦20 ¦Бачок или ведро емкостью 12 л для сбора отходов ¦ 2 ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦21 ¦Восковой карандаш (для стекла) или тушь ¦ 2 ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦22 ¦Дезинфектант, бактерицидный (хлорамин) ¦ 20 л ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦23 ¦Фильтровальная бумага ¦ 10 кор.¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦24 ¦Воронки с фильтрами, стеклянные, диаметром 90 мм ¦ 3 ¦
¦ ¦или 125 мм ¦ ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦25 ¦Емкость с отмытым речным песком и 96-градусным ¦ 1 ¦
¦ ¦спиртом ¦ ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦26 ¦Раковина (по возможности с проточной водой или с ¦ 1 ¦
¦ ¦дополнительной емкостью для воды) ¦ ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦27 ¦Одноразовые перчатки ¦4000 ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦28 ¦Аппарат для получения дистиллированной воды ¦ 1 ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦29 ¦Лабораторный журнал ¦ 1 ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦30 ¦Бланки направления на лабораторное исследование ¦ 4000 ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦31 ¦Халаты, полотенца ¦По потр. ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦ Реактивы ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦1 ¦Водный раствор метиленового синего ¦ 4 л ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦2 ¦Карболовый фуксин ¦ 12 л ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦3 ¦Спиртовой насыщенный р-р основного фуксина ¦ 6 л ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦4 ¦Этанол ¦ 26 л ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦5 ¦Соляная кислота, концентрированная ¦ 1 л ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦6 ¦Серная кислота, концентрированная ¦ 3 л ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦7 ¦Фенол ¦ 600 г ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦8 ¦Ксилол ¦ 400 мл ¦
+---+----------------------------------------------------+---------+
¦9 ¦Иммерсионное масло ¦ 400 мл ¦
¦---+----------------------------------------------------+----------
2. Сбор мокроты для анализа
Эффективность лабораторного исследования по выявлению кислотоустойчивых микобактерий в значительной степени зависит от правильности сбора диагностического материала. От соблюдения правил сбора, хранения и транспортировки диагностического материала зависит не только достоверность получаемых результатов, но и эпидемиологическая безопасность окружающих.
Мокрота собирается в специальные стеклянные баночки емкостью около 50 мл с герметически завинчивающимися крышками, доставляется для исследования в лабораторию. Для сбора мокроты могут применяться также плевательницы из темного стекла с герметически завинчивающимися крышками, которые, как и баночки, используются многократно после мытья и стерилизации кипячением в течение не менее 30 минут. Необходимо использовать баночки с широким горлышком (диаметр не менее 35 мм), чтобы пациент мог легко собрать мокроту без контаминации наружной поверхности баночки. Мокроту можно собирать также в одноразовые плевательницы, которые после использования подлежат уничтожению. Посуда для сбора мокроты должна быть сделана из прозрачного материала, чтобы можно было определить количество и состояние собранного материала, не открывая крышку баночки.
Сведения о пациенте приводятся на бумажной этикетке, прикрепленной на наружную стенку баночки или плевательницы. В этикетке указывается фамилия, имя, отчество, год рождения, дата забора мокроты, адрес больного и наименование медицинского учреждения. На исследование направляются три пробы мокроты от каждого пациента. Лучше использовать утреннюю порцию мокроты.
Первая проба. Мокрота собирается при первичном обращении пациента в больницу или поликлинику (утром) под наблюдением медицинского работника.
Вторая проба. Мокрота собирается больным в тот же день с промежутком в 1,5 - 2 часа после взятия первой пробы в присутствии медицинского работника.
Третья проба. Мокрота собирается самим больным утром следующего дня и доставляется им в лабораторию.
Можно рекомендовать следующую методику сбора трех образцов мокроты:
- первый образец - при первичном обращении больного в медицинское учреждение;
- второй образец, собранный рано утром на следующий день после первого обращения больного;
- третий образец - непосредственно в медицинском учреждении, когда пациент принесет на исследование собранный утром второй образец мокроты.
Во время продуктивного кашля образуется аэрозоль, содержащий туберкулезные микобактерии. В целях обеспечения мер безопасности при откашливании мокроты пациентом и предупреждения инфицирования потенциально заразными аэрозолями медицинского персонала сбор мокроты должен осуществляться в специально оборудованном помещении, оснащенном бактерицидными лампами, локальной вытяжной вентиляцией, в присутствии медицинского персонала с обязательным проведением инструктажа о правилах сбора мокроты (приложение 3.1). Если условия этого не позволяют, то сбор мокроты проводят вне помещения (на открытом воздухе) или в помещении, где нет других людей, под контролем медицинского работника. В любом случае нельзя собирать мокроту в замкнутых помещениях. Собранные образцы мокроты от одного пациента не объединяют в одном сосуде, а направляют в лабораторию с указанием сведений о пациенте для каждой пробы (приложение 3.2).
Сразу после взятия материал для исследования должен быть доставлен в лабораторию. Если транспортировка откладывается, собранную мокроту следует хранить в холодильнике при 4 град. C не более 2 дней или в консерванте (3 - 5 суток).
Для хранения и перевозки мокроты необходимо использовать специальные контейнеры, металлические биксы.
Биксы, в которых находятся плевательницы с мокротой, до перевозки следует хранить в холодильнике. Если у больного мало мокроты, можно использовать мокроту, собранную в течение суток, при условии, что она будет храниться в холодильнике. При этом ни в коем случае нельзя допускать ее замораживания.
При необходимости посева мокрота собирается в стерильную плевательницу и сохраняется в холодильнике не более 1 дня.
При отсутствии возможности доставить мокроту в медицинское учреждение можно приготовить хорошо зафиксированные мазки и переправить их в лабораторию. В ряде случаев, когда больному трудно откашлять мокроту, прибегают к специальным методам, например, стимуляции выделения мокроты. Мокрота, собранная после специальной стимуляции, по внешнему виду напоминает слюну, поэтому такой материал направляют в лабораторию со специальной маркировкой ("индуцированная мокрота").
3. Приготовление мазков
В лаборатории, функции которой ограничены только микроскопическим исследованием окрашенных по Цилю-Нильсену мазков из нативного материала, используется световая микроскопия. Микроскопическое исследование на туберкулез должно проводиться в отдельной комнате с соблюдением правил безопасности, поточности движения и обработки материала. В объединенных клинико-диагностических лабораториях для бактериоскопических исследований на туберкулез должно выделяться отдельное помещение. Стены, потолки и полы помещения, в котором проводится бактериоскопическое исследование, должны быть покрыты гладким, неадсорбирующим материалом, который можно легко мыть и дезинфицировать.
В помещении для микроскопии должно быть четыре зоны:
- зона для приема и регистрации диагностического материала;
- хорошо освещенное место для приготовления и окраски мазков;
- место для микроскопирования;
- место для регистрации результатов исследований.
Поступающие в лабораторию пробы для бактериоскопического исследования принимают на отдельном столе. Прием следует проводить в одноразовых перчатках. Необходимо проверить, нет ли повреждений баночек (трещин, сколов), следов протечки материала на поверхности. В случае разбивания баночек во время транспортирования пробы подлежат уничтожению (автоклавирование или сжигание, или кипячение). Необходимо продезинфицировать наружную и внутреннюю поверхность транспортного бикса тампоном, смоченным дезинфектантом, обладающим микобактерицидным действием, например, 5-процентным раствором фенола.
Подробные сведения о каждом пациенте с описанием характера мокроты заносят в лабораторный журнал регистрации бактериоскопических исследований (приложение 3.3).
Приготовление мазков для микроскопического исследования является весьма ответственной процедурой, во многом предопределяющей успех исследования. При этом необходимо иметь в виду, что туберкулез распространяется воздушно-капельным путем через содержащие возбудитель мельчайшие аэрозольные частицы, диаметр которых составляет 1 - 5 мкм. Для предупреждения случаев внутрилабораторного заражения необходимо свести к минимуму возможность образования аэрозолей. Для защиты персонала лабораторий от инфицирующих частиц нужна хорошая вентиляция помещений лаборатории и необходимое направление движения воздуха - это правильное расположение окон и дверей.
Процедура приготовления мазков начинается с подготовки предметных стекол. Необходимо использовать только новые отмытые, обезжиренные в спирте или смеси Никифорова стекла без царапин и сколов. При повторном использовании стекол они могут быть недостаточно хорошо отмыты от предыдущего материала, что может привести к получению ложноположительных результатов.
Новые предметные стекла для очистки кипятят в 1-процентном растворе питьевой соды, после чего промывают водой, затем в 1-процентном растворе соляной кислоты и снова проточной водой, затем протирают насухо. Вымытые стекла хранят в стеклянных банках с притертой пробкой в 96-градусном спирте или смеси Никифорова. Стекла должны подвергаться обезжириванию не менее 24 - 48 часов. Их можно вынуть из спирта, вытереть досуха и сохранять в стеклянных банках.
Стекло подписывают тушью или восковым карандашом. Номер, проставленный на стекле, должен соответствовать номеру исследования по лабораторному журналу регистрации бактериоскопических исследований на КУБ.
Бактерии чаще обнаруживаются в плотных гнойных частицах мокроты. Результат исследования в большой степени зависит от правильного выбора таких частиц.
Баночку (плевательницу) открывают медленно и аккуратно, избегая разбрызгивания мельчайших заразных капелек (аэрозоля мокроты). Можно гомогенизировать мокроту с использованием встряхивателя в течение 30 минут. Обожженной в пламени спиртовки и охлажденной бактериологической петлей или сломанными концами деревянной палочки (новой для каждой порции мокроты) захватывают небольшое количество мокроты с гнойными комочками. Гнойный комочек мокроты распределяют на предметном стекле как можно более тонким слоем на площади приблизительно 1 х 2 см. Мазок должен быть достаточно тонким, так как в противном случае он может быть смыт с предметного стекла в процессе промывки. Толщина мазка в высушенном неокрашенном состоянии должна быть такой, чтобы можно было прочитать газетный текст, лежащий под мазком, с расстояния 5 - 10 см. На каждом предметном стекле делается не более одного мазка. Если мокрота очень вязкая, небольшой гнойный комочек захватывают пинцетом, осторожно отрезают ножницами и наносят его на середину предметного стекла. Пинцет и ножницы обжигают в пламени спиртовой горелки. Из очень вязких образцов мокроты частицы можно извлекать также с помощью второй обожженной петли.
Приготовление мазков для микроскопического исследования является одной из самых опасных процедур, во время которой происходит рассеивание аэрозолей, содержащих возбудитель. Необходимо обжигать петлю после каждой манипуляции в пламени спиртовой горелки до тех пор, пока она не станет красной. Перед обжиганием крупные частицы мокроты можно удалить с петли движениями ее вверх-вниз во флаконе с песком и 70-градусным спиртом или лизолом, покрывающем песок не менее чем на 3 см. Если песок и спирт находятся во флаконе емкостью 300 - 500 мл с завинчивающейся крышкой, флакон можно использовать долгое время, периодически заменяя спирт. Чтобы предупредить разбрызгивание заразного материала при обжигании петли, рекомендуется нагревать ее, начиная с конца, впаянного в держатель, постепенно передвигая в пламени до появления дыма на ее загнутом кончике. После этого петлю можно прокалить в вертикальном положении до покраснения.
Перед повторным использованием петлю тщательно прокаливают в пламени горелки, которое при этом должно быть бесцветным или голубым. Оранжевый или красный цвет пламени свидетельствует о недостаточном прожигании бактериологической петли.
Приготовленные мазки подсушивают при комнатной температуре в течение 15 минут на мостике для сушки и окрашивания мазков. Не допускается подсушивание мазков над пламенем горелки. Лаборант должен планировать свой рабочий день таким образом, чтобы закончить приготовление, фиксацию, окраску и просмотр препаратов к концу дня. Если исследование не удается закончить, предметные стекла с мазками оставляют на ночь в закрытой коробке, чтобы предотвратить возможность повреждения их и распыления заразного материала, а также исключить доступ к ним насекомых и грызунов.
Высушенный мазок фиксируют трехкратным проведением его в течение 3 - 5 секунд через среднюю наиболее яркую часть пламени спиртовки до исчезновения признаков запотевания стекла. Не допускается фиксирование сырых мазков. Для фиксирования можно поместить мазки на электронагреватель для сушки предметных стекол при температуре 65 - 75 град. C на 2 часа. Когда все мазки будут зафиксированы, следует обработать пламенем пустой мостик.
Безопасным для персонала является метод фиксации мазков, используемый при окраске по методу Циля-Нильсена, предложенный A.Hain. Предметные стекла с мазками раскладывают на жестяные подносы и помещают в сушильный шкаф, где высушивают при 37 град. C. Затем температуру повышают до 105 град. C, и спустя 10 минут шкаф выключают. При таком методе достигается надежное прикрепление мазка к стеклу и гибель микобактерий, как находящихся в материале, так и случайно попавших на поднос. Окружающая температура не должна превышать 105 град. C, чтобы не изменить тинкториальные свойства микобактерий.
Необходимо ежедневно готовить контрольные достоверно положительные и достоверно отрицательные мазки для контроля качества красителей и методики окрашивания и включать их в число исследуемых мазков, особенно если за 1 день просматривается менее 10 мазков. Отрицательный контроль необходим для того, чтобы убедиться, что растворы красителей не контаминированы КУБ. В бактериологических лабораториях допускается приготовление мазков из осадка после обработки мокроты 10-процентным трехзамещенным фосфорнокислым натрием в течение 24 часов с последующим центрифугированием в течение 20 минут при 3000 об/мин.
4. Методика окрашивания
Маркированные предметные стекла помещают на полочку или мостик мазками вверх с промежутками между краями. Мазки накрывают полоской фильтровальной бумаги. На всю поверхность фильтровальной бумаги, покрывающей стекло, наносят раствор карболового фуксина. Вместо использования полосок фильтровальной бумаги можно карболовый фуксин налить через воронку со складчатым фильтром непосредственно на мазок. Медленно нагревают стекло с мазками над пламенем спиртовки до появления пара. Не допускается кипение или полное испарение окрашивающего раствора на предметном стекле. Если раствора недостаточно, его нужно добавить еще и нагреть во второй раз. Мазок с прогретым раствором оставляют на 5 минут, после чего фильтровальную бумагу удаляют пинцетом и помещают ее в бачок для сбора отходов. Каждое предметное стекло аккуратно ополаскивают отдельно под слабой струей воды до полного удаления окрашивающего раствора. Мазок смывают ребром к струе. Не разрешается смывать и обесцвечивать одновременно несколько мазков во избежание перекрестной контаминации. Все стекла с мазками помещают на мостик и обрабатывают каждый из них индивидуально 25-процентным раствором серной кислоты в течение 3 минут. Смывают каждое предметное стекло, как описано выше. Воздействие раствора серной кислоты (или 3-процентного раствора солянокислого спирта) приводит к обесцвечиванию всех некислотоустойчивых структур. Только микобактерии, обладающие кислото- и спиртоустойчивостью, стойко удерживают краситель и остаются окрашенными в красный цвет. Обесцвеченные элементы мазка дополнительно докрашивают метиленовым синим в течение 60 секунд, промывают, как описано выше, оставляют сушить на воздухе. Не следует промокать препарат. Для предотвращения контаминации хранящихся реактивов запрещается сливать неиспользованные реактивы назад в бутыли.
Люминесцентная микроскопия мазков мокроты может проводиться в крупных лабораториях, где ежедневно исследуется более 100 мазков. Преимущество флуоресцентного метода микроскопии заключается в возможности просмотра большей площади мазка, поскольку при микроскопии мазков, окрашенных флуорохромами, используют объектив с меньшим увеличением. Однако использование объектива с меньшим увеличением увеличивает вероятность ложноположительных результатов вследствие ошибочного принятия артефакта за микобактерии. Поэтому все положительные мазки должны быть дополнительно просмотрены при большем увеличении. Кроме этого, необходима подтверждающая микроскопия мазков, окрашенных по Цилю-Нильсену.
При окраске мазков флуорохромами необходимо:
- избегать неполного обесцвечивания;
- готовить достаточно тонкие мазки, поскольку излишняя толщина мазка препятствует качественному обесцвечиванию, а дополнительное докрашивание может скрыть наличие микобактерий. Кроме этого, толстые мазки плохо фиксируются на предметном стекле, в силу чего могут быть смыты в процессе окрашивания;
- избегать чрезмерно интенсивного докрашивания, скрывающего наличие микобактерий.
Мазки, окрашенные флуорохромами, рекомендуется вновь использовать для окрашивания по методу Циля-Нильсена для подтверждающей микроскопии. Однако после этого они не пригодны для люминесцентной микроскопии.
5. Исследование под микроскопом
Для исследования окрашенных мазков наиболее подходит бинокулярный микроскоп с масляным иммерсионным объективом (x 100) и окуляром (x 7) или (x 10). Можно пользоваться монокулярным микроскопом, используя электрическое или естественное освещение. Необходимо просмотреть в определенном порядке весь мазок. Например, если исследование начато в центре левого края мазка, поворотом винта, вращающего столик микроскопа, очень медленно, систематически исследовать мазок, начиная с периферии и заканчивая центром правого края. Рекомендуется микроскопировать препарат на протяжении не менее 5 минут. Этого времени достаточно, чтобы просмотреть не менее 100 подходящих полей зрения. Подходящими считаются поля зрения, в которых видны клеточные элементы бронхиального происхождения (лейкоциты, слизистые тяжи и клетки эпителия). Поля зрения, не содержащие таких элементов, не учитываются. Количество полей зрения по длине мазка соответствует как минимум 100. В случае, когда результат такого исследования оказывается отрицательным, для подтверждения рекомендуется просмотреть еще 200 полей зрения. Таким образом, можно изучить все микроскопическое поле мазка (300 полей зрения). Суммарное время, затрачиваемое на микроскопическое исследование одного мазка (регистрация, приготовление, окраска, микроскопия), составляет 25 - 30 минут. На микроскопию одного препарата в среднем затрачивается 13 минут. Во избежание загрязнения иммерсионного масла нельзя прикасаться пипеткой к мазку, капля масла должна свободно упасть на мазок. Не следует допускать попадания иммерсионного масла на предметный столик микроскопа. После просмотра каждого препарата следует тщательно протирать объектив от иммерсионного масла марлевыми салфетками, смоченными в 70-градусном, а затем в 96-градусном спирте, чтобы предотвратить контаминацию следующего мазка. Марлевые салфетки затем опускают в бак для отходов.
Кислотоустойчивые бактерии (КУБ) - тонкие малиново-красные палочки длиной 1 - 10 (чаще 1 - 4) мкм, слегка изогнутые, более или менее зернистые. Изолированные, либо располагаются парами, группами; хорошо видны на голубом фоне мазка. Подсчитывают количество КУБ в мазке. Различную степень кислотоустойчивости, которая выявляется при окрашивании по Цилю-Нильсену, можно наблюдать не только у разных видов микобактерий, но и у других микроорганизмов. Это могут быть различные виды Rhodococcus, Nocardia, Legionella, а также цисты Cryptosporidium и Isospora. Быстрорастущие микобактерии могут различаться по степени кислотоустойчивости (в случае частичной потери кислотоустойчивости они могут окрашиваться в фиолетово-малиновый цвет). В сомнительных случаях рекомендуется длительно (в течение 45 - 60 минут) обесцвечивать мазок в солянокислом спирте. Сапрофиты при этом теряют окраску и выглядят в виде палочек голубого цвета.
После окончания просмотра мазки опускают в ксилол для удаления иммерсионного масла, а затем хранят их в коробке с исследованными мазками.
6. Учет и интерпретация результатов исследования
Основным диагностическим материалом для бактериоскопии на КУБ служит мокрота. Результаты бактериоскопического исследования на КУБ других биологических материалов (различных жидкостей, тканей, гноя, мочи и т.д.) имеют ограниченное значение. Так, исследование мазков из осадка центрифугированной мочи не всегда позволяет получить достоверные результаты, поскольку в моче могут присутствовать нетуберкулезные микобактерии. Этот факт в некоторых случаях объясняется неправильным сбором материала. В связи с этим выявление КУБ в моче не всегда свидетельствует о наличии специфического процесса. В мазках из осадка промывных вод желудка и других материалов могут обнаруживаться кислотоустойчивые сапрофиты, которые легко спутать с МБТ. Поэтому при необходимости выявления возбудителя туберкулеза в различных биологических материалах рекомендуется использовать культуральный метод исследования.
Результат микроскопического исследования позволяет сделать заключение только о наличии или отсутствии в препарате кислотоустойчивых бактерий. Достоверный диагноз может быть установлен только после выделения из клинического материала и идентификации культуры туберкулезных микобактерий с использованием культурального метода. Отрицательный результат бактериоскоскопического исследования не исключает диагноз туберкулеза, так как в мокроте некоторых пациентов может содержаться меньше микобактерий, чем позволяет выявить бактериоскопия. Чтобы обнаружить микобактерии туберкулеза при проведении бактериоскопии, в 1 мл мокроты должно содержаться 5000 - 10000 и более бактериальных клеток. Причиной отрицательного результата микроскопического исследования может быть плохая подготовка мазков мокроты.
Количество обнаруженных КУБ определяет тяжесть заболевания и опасность больного для окружающих. Следовательно, исследование должно быть не только качественным, но и количественным. Регистрация результатов с указанием количества обнаруженных КУБ проводится следующим образом:
ГРАДАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
ПРИ ОКРАСКЕ ПО ЦИЛЮ-НИЛЬСЕНУ (1000Х)
-------------------+-------------+---------------------------------¬
¦ Количество ¦ Число ¦ Ответ ¦
¦кислотоустойчивых ¦иммерсионных ¦ ¦
¦ бактерий (КУБ) ¦полей зрения ¦ ¦
+------------------+-------------+---------------------------------+
¦КУБ отсутствуют ¦ 100 ¦Кислотоустойчивые бактерии не ¦
¦ ¦ ¦обнаружены (в 100 полях зрения ¦
¦ ¦ ¦КУБ не выявлены) ¦
+------------------+-------------+---------------------------------+
¦От 1 до 9 КУБ ¦ 100 ¦Указать точное количество ¦
¦ ¦ ¦(1 - 9 КУБ на 100 полей зрения) ¦
+------------------+-------------+---------------------------------+
¦От 10 до 99 КУБ ¦ 100 ¦1+ ¦
¦ ¦ ¦Указать точное количество ¦
¦ ¦ ¦(10 - 99 КУБ на 100 полей зрения)¦
+------------------+-------------+---------------------------------+
¦От 1 до 10 КУБ ¦ 1 ¦2+ ¦
¦ ¦ ¦(1 - 10 КУБ на одно поле зрения в¦
¦ ¦ ¦50 просмотренных полях зрения) ¦
+------------------+-------------+---------------------------------+
¦Более 10 КУБ ¦ 1 ¦3+ ¦
¦ ¦ ¦(более 10 КУБ на одно поле зрения¦
¦ ¦ ¦в 20 просмотренных полях зрения) ¦
¦------------------+-------------+----------------------------------
Выявление трех и менее КУБ в 100 полях зрения плохо коррелирует с положительным результатом культурального исследования.
7. Регистрация результатов исследования
Результаты бактериоскопического исследования отражаются в двух документах: общем журнале учета бактериоскопических исследований и на бланках, на которых результаты исследования сообщаются в направившее материал на исследование лечебное учреждение. Результаты микроскопии следует отослать как можно быстрее, желательно в течение 24 часов с момента получения проб мокроты. В заключительном ответе должна быть приведена следующая информация:
- характеристика качества собранной мокроты;
- использованный метод окраски;
- количество КУБ в мазке;
- выявление больших скоплений КУБ, что может свидетельствовать о гораздо большем количестве бактерий, чем указано в заключении;
- дата исследования и фамилия сотрудника, проводившего исследование.
Мазок с обнаруженными КУБ является документом, от которого зависит постановка диагноза туберкулеза легких у конкретного человека. Его следует хранить в лаборатории, а результаты необходимо подтвердить повторным исследованием. Положительные мазки помещают в специальный ящик и хранят в течение года. Затем мазки обеззараживают погружением в дезраствор, кипячением или автоклавированием и вывозят на свалку.
10% отрицательных мазков хранят в лаборатории в течение года, с тем, чтобы при необходимости провести проверку достоверности результатов. После этого их можно уничтожить.
8. Составление реактивов
А. Карболовый фуксин Циля
Для приготовления 100 мл окрашивающего раствора используют реактивы в следующих количествах:
1) Насыщенный спиртовой раствор фуксина
- основной фуксин 3,0 г
- 96-процентный этиловый спирт 100 мл
2) Раствор фенола:
- кристаллы фенола 5,0 г
- дистиллированная вода 100 мл
Медленно нагревают кристаллы фенола во флаконе до жидкого состояния и доливают до 90 мл воды. В полученный раствор фенола добавляют 10 мл насыщенного раствора фуксина. Раствор переливают в бутыль из темного стекла, пишут на этикетке название раствора, дату приготовления и срок хранения. Раствор может храниться при комнатной температуре в течение 6 - 12 месяцев. Перед использованием раствора его следует профильтровать.
Кристаллический фенол должен храниться в плотно закрытой посуде (флаконе) в холодильнике.
В. Реактивы для обесцвечивания
1) 25-процентный раствор серной кислоты
Наливают 300 мл воды в литровую бутылку. Медленно добавляют 100 мл концентрированной серной кислоты, наливая ее по стенке бутылки, смешивают. Пишут на этикетке название раствора, дату приготовления и срок хранения. Раствор может храниться в бутыли из темного стекла при комнатной температуре в течение 6 - 12 месяцев. Никогда не наливать воду в серную кислоту!
2) 3-процентный кислотно-спиртовой раствор
концентрированная соляная кислота 3 мл
96-процентный этиловый спирт 97 мл
Аккуратно добавляют концентрированную соляную кислоту к 96-процентному спирту. Никогда не наливать спирт в соляную кислоту! Раствор может храниться в бутыли из темного стекла при комнатной температуре в течение 6 - 12 месяцев.
С. Реактивы для повторного окрашивания:
Метиленовый синий
- хлорид метиленового синего 5,0 г
- дистиллированная вода 100 мл.
9. Контроль и обеспечение качества
бактериоскопических исследований
Контроль качества - это процесс эффективного и систематического мониторинга всей работы лаборатории в сравнении с установленными стандартами. Контроль качества служит гарантией того, что предоставляемая лабораторией информация является точной, надежной и воспроизводимой; он фактически является механизмом, с помощью которого лаборатория подтверждает свою компетентность.
Обеспечение качества микроскопических исследований при выявлении туберкулеза осуществляется в нескольких направлениях:
- контроль качества исследований, включающий как внутрилабораторный контроль качества, осуществляемый регулярно самими лабораториями, так и внешнюю оценку качества - кураторские визиты с целью оценки соответствия деятельности лаборатории правилам проведения лабораторных работ, состояния оборудования и выполнения норм техники безопасности;
- обучение персонала;
- лицензирование лаборатории.
Внутрилабораторный контроль качества включает широкий спектр процедур:
- оценка качества поступающих проб и обработки материала;
- контроль правильности приготовления и сроков хранения реактивов;
- контроль правильности исполнения метода и его документирования;
- контроль исправности оборудования;
- оценку достоверности результатов путем использования заведомо положительных и отрицательных контролей.
За обеспечение качества исследования несут ответственность все сотрудники лаборатории. Основное внимание инспекторских проверок должно быть уделено контролю и стандартизации используемого метода. Лаборатории противотуберкулезных учреждений осуществляют контроль работы клинико-диагностических лабораторий всех уровней. В курируемой лаборатории все позитивные и 10% негативных мазков бактериоскопических исследований на туберкулез должны сохраняться в течение года для осуществления их контрольного чтения - и подтверждения качества исследований специалистами-кураторами из противотуберкулезных учреждений.
Очень важным моментом в реализации программы обеспечения качества бактериоскопических исследований является информация персонала лабораторий о результатах проверки с рекомендацией корригирующих мероприятий по устранению отмеченных недостатков (приложение 3.4).
Внешняя оценка качества микроскопических исследований должна включать проверку достоверности и сравниваемости результатов, полученных в лаборатории, с результатами, полученными другими лабораториями. Внешний контроль качества может осуществляться с использованием набора стандартных препаратов, представляющих собой неокрашенные и окрашенные мазки мокроты, содержащие разное количество КУБ. Каждый набор должен включать не менее 5 препаратов, например:
- отрицательный - 2 препарата;
- менее 10 КУБ - 1 препарат;
- 1+ - 1 препарат;
- 2+ - 3+ - 1 препарат.
Внешний контроль качества по контрольным образцам следует проводить не менее 2 раз в год. Использование окрашенных и неокрашенных мазков мокроты позволяет выявлять погрешности, имеющие место на стадии окраски мазков и их микроскопического исследования.
10. Меры безопасности при работе с инфекционным материалом
Каждый медицинский работник отвечает за собственную безопасность и безопасность своих коллег по работе.
Весь персонал должен работать в медицинском халате, застегивающемся сзади, медицинском колпаке. При работе с инфекционным материалом необходимо пользоваться резиново-клеенчатым передником, резиновыми перчатками, точно выполнять технические приемы и соблюдать меры предосторожности, предусмотренные правилами исследования, при сборе и распаковке заразного материала. Матерчатые или бумажные лицевые маски (например, хирургические) не обеспечивают защиту медработника от вдыхания взвешенных в воздухе капельных частиц, содержащих инфекционный агент.
При работе с мокротой следует сводить к минимуму выполнение лабораторных манипуляций, которые создают инфицирующие аэрозоли (мельчайшие капельки мокроты). К появлению аэрозолей в лаборатории приводит:
- открывание плевательниц с мокротой, что особенно опасно в тех случаях, когда мокрота затекла и высохла между крышкой и стенкой плевательницы, или если мокроту взбалтывали пред открыванием плевательницы;
- приготовление мазков на предметных стеклах;
- прожигание бактериологических петель, используемых для переноса материала на стекло;
- попытки фиксировать над горелкой невысохший влажный мазок, что приводит к вскипанию и разбрызгиванию частичек материала.
В целях максимальной защиты лаборантов от заражения необходимо приготовление и фиксацию мазков проводить в настольном вытяжном шкафу, микроскопию мазков проводить отдельно от места приготовления и окраски мазков. В лаборатории также необходимо иметь раковину с проточной водопроводной водой. Для защиты персонала лабораторий от инфицирующих частиц необходима система вытяжной вентиляции и использование бактерицидных ламп ультрафиолетового облучения. Запрещается принимать пищу и курить за рабочим столом. Манипуляции следует выполнять только на лотке, который необходимо стерилизовать каждый день после использования либо огнем, либо обработкой 5-процентным раствором хлорамина. Во время приготовления мазков окна и двери должны быть закрыты. Случайно залитые или забрызганные заразным материалом места на столах, полу и пр. необходимо немедленно залить дезинфицирующим раствором и оставить его на месте в течение не менее 1 часа, включить вытяжную вентиляцию, покинуть комнату.
После прикосновения руками к заразному материалу необходимо немедленно их дезинфицировать. Это надо делать также перед уходом из лаборатории.
Поверхности столов и лотков смачиваются дезраствором и оставляются в таком состоянии на 6 часов, а затем промываются теплым 2-процентным содовым раствором.
По окончании манипуляций с заразным материалом предметы подлежат немедленной дезинфекции (погружаются или заливаются 5-процентным хлорсодержащим раствором на 4 часа). После окончания препарирования окна и двери должны быть открыты для проветривания.
Баночки или плевательницы с мокротой складывают в бак или ведро для обеззараживания. Лабораторную посуду, бывшую в употреблении, дезинфицируют путем кипячения в течение 30 минут с момента закипания в мыльно-содовом растворе. Во время нагревания плевательницы должны быть полностью покрыты кипящей жидкостью. После кипячения лабораторную посуду моют для повторного использования. Возможна также дезинфекция лабораторной посуды путем автоклавирования или путем погружения в один из дезрастворов. Пинцеты, сушилки, мостики, кюветы обрабатывают пламенем или заливают дезинфицирующим раствором (5-процентный раствор карболовой кислоты или 5-процентный раствор хлорамина, или 2,5-процентный активированный хлорамин).
Транспортировочные коробки или биксы очищаются ватными тампонами, пропитанными дезраствором.
После окончания работы перчатки персонала и пинцеты кипятят в течение 15 минут с момента закипания в кастрюле в 2-процентном содовом растворе.
Халаты, полотенца, маски обеззараживают путем замачивания в 5-процентном растворе хлорамина в течение 4 часов (5 литров раствора на 1 кг белья) или в 1-процентном активированном растворе хлорамина в течение 2 часов. После этого белье кипятят около 30 минут, а затем стирают обычным способом.
11. Причины возможных ошибок при выполнении бактериоскопии
мазка мокроты и пути их устранения
Ошибки, связанные с организацией бактериоскопического обследования на туберкулез:
- несоблюдение показаний к данному виду обследования, связанное с недостаточной подготовленностью врачей общей практики по тактике выявления туберкулеза в современных условиях;
- плохое материальное оснащение лаборатории (отсутствие бинокулярных микроскопов);
- неправильная регистрация результатов;
- недостаточная подготовка персонала лабораторий.
Ошибки, связанные с исследуемым материалом:
- плохое качество или недостаточное количество исследуемого материала; отсутствие кратности исследования;
- плохая обработка многоразовых флаконов для сбора материала, в которых могут оставаться микобактерии, что служит причиной ложноположительных результатов.
Ошибки, связанные с приготовлением мазка:
- недостаточная освещенность рабочего места;
- приготовление слишком большого количества мазков одновременно. Рекомендуется за прием делать не более 12 мазков;
- путаница, связанная с неправильной маркировкой предметных стекол;
- повторное исследование предметных стекол после положительного предыдущего мазка. По истечении срока хранения (1 год) такие стекла следует уничтожать;
- использование загрязненных бактериологических петель или деревянных палочек.
Ошибки, связанные с процессом окрашивания:
- использование предметных стекол с царапинами и другими дефектами;
- использование непрофильтрованного раствора фуксина, содержащего кристаллы;
- неправильное подогревание фуксина; испаряясь, фуксин может кристаллизоваться на стекле;
- недостаточное обесцвечивание мазка, что может привести к сохранению красного окрашивания некоторых сапрофитных бактерий.
Ошибки, связанные с микроскопированием:
- наличие КУБ в иммерсионном масле вследствие касания мазка палочкой для нанесения масла (возможно инфицирование всей порции иммерсионного масла во флаконе);
- наличие КУБ в иммерсионном масле вследствие плохой очистки иммерсионных линз после микроскопирования положительных препаратов;
- отсутствие номера на стекле, если при окрашивании он был смыт;
- изменчивость возбудителя.
12. Противопоказания к применению
Противопоказаний к применению не имеется, так как данный метод относится к лабораторным исследованиям.
Приложение 3.1
ПРАВИЛА СБОРА МОКРОТЫ
- Добейтесь взаимопонимания с больным и объясните ему, для чего необходимо провести исследование мокроты. Расскажите пациенту, что следует откашливать мокроту из глубоких отделов легких. Объясните больному, что он не должен собирать слюну или носоглоточную слизь.
- Проинструктируйте больного, чтобы он прополоскал рот перед сдачей мокроты. При этом из полости рта удаляются остатки пищи и контаминирующие бактерии.
- Пациент должен сделать два глубоких вдоха, задержать дыхание на несколько секунд после каждого вдоха и затем медленно выдохнуть. Затем попросите больного вдохнуть в третий раз и с силой выдохнуть воздух. Потом попросите вдохнуть еще раз и затем покашлять. Это способствует получению мокроты из глубоких отделов легких. После появления продуктивного кашля пациент должен поднести к губам контейнер и аккуратно сплюнуть в него мокроту. Нередко мокрота бывает густой и слизистой, хотя может быть жидкой с частицами некротических тканей из пораженных участков легких. Цвет мокроты может быть грязно-белым или грязновато-светлозеленым. Мокрота с кровью имеет красный или коричневый цвет. Жидкая прозрачная слюна или выделения из носоглотки не являются мокротой и имеют небольшую ценность в диагностике туберкулеза. Для исследования необходимо получить достаточное количество мокроты (3 - 5 мл), содержащей плотные гнойные частицы, а не слюну.
- Если мокроты собрано недостаточно, попросите больного покашлять еще, чтобы получить образец достаточного объема. Надо помнить о том, что многие пациенты не в состоянии собрать мокроту в течение нескольких минут. Необходимо дать им достаточно времени и дождаться действительно глубокого кашля.
- Если все-таки мокроту получить не удалось, считайте, что данный контейнер все равно использован и утилизируйте его в соответствии с инструкцией.
- Проверьте, чтобы контейнер был плотно закрыт и чтобы был четко маркирован сам контейнер, а не его крышка.
- Поставьте контейнер в бикс для транспортировки в лабораторию.
- Вымойте руки в перчатках с мылом.
- Дайте пациенту новый контейнер и объясните, что важно собрать мокроту утром, как только он проснется.
- Покажите пациенту, как следует плотно закрыть контейнер.
- Объясните больному, куда он должен доставить мокроту (в медицинское учреждение или в лабораторию).
Приложение 3.2
Направление на лабораторное исследование <*>
Номер образца ___________________________ Дата _____________________
Наименование медицинского учреждения _______________________________
Фамилия, имя, отчество больного ____________________________________
--¬ --¬
Возраст __________________________ Пол М ¦ ¦ Ж ¦ ¦
L-- L--
Точный адрес _______________________________________________________
Номер истории болезни __ (при мониторинге процесса лечения больного)
--¬ --¬
Откуда получен образец ¦ ¦ Из легких ¦ ¦ Из внелегочного очага -
L-- L-- локализация ___________
--¬ --¬
Причина обследования: ¦ ¦ Диагностика ¦ ¦ Мониторинг лечения
L-- L--
Подпись лица, направляющего пробу на исследование __________________
Номер по лабораторному журналу ___________
Внешний вид мокроты
Слизисто-гнойная Окрашена кровью Слюна
--¬ --¬ --¬
Образец 1 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
L-- L-- L--
--¬ --¬ --¬
Образец 2 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
L-- L-- L--
--¬ --¬ --¬
Образец 3 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
L-- L-- L--
Результаты бактериоскопии
--¬ --¬
Метод окраски ¦ ¦ по Цилю-Нильсену ¦ ¦ флуорохромом
L-- L--
-----+-------+-----------------+-----------------------------------¬
¦Дата¦ Проба ¦ Результат <**> ¦Положительные результаты (в баллах)¦
¦ ¦ ¦ +------+------+------+--------------+
¦ ¦ ¦ ¦ 3+ ¦ 2+ ¦ 1+ ¦ 1 - 9 КУБ ¦
+----+-------+-----------------+------+------+------+--------------+
¦ ¦ 1 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+----+-------+-----------------+------+------+------+--------------+
¦ ¦ 2 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+----+-------+-----------------+------+------+------+--------------+
¦ ¦ 3 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
¦----+-------+-----------------+------+------+------+---------------
--------------------------------
<*> Данная форма направления на лабораторное исследование
используется в лабораторной практике по рекомендации ВОЗ.
<**> Укажите отрицательный или положительный результат.
Дата ___________________
Исследование проведено __________________________ (подпись)
Приложение 3.3
Лабораторный журнал <*>
Лабораторный номер
Дата
Фамилия, имя, отчество (полностью)
Пол М/Ж
Возраст
Полный адрес (для новых больных)
Название медицинского учреждения, направившего пробу
Причина исследования
Диагностика
Мониторинг
Результаты бактериоскопии
1
2
3
Подпись
Примечания
Если образец мокроты направлен на диагностическое исследование,
поставьте значок "V" в графе "Диагностика".
Если образец мокроты "направлен на контрольное исследование в
процессе лечения, укажите регистрационный номер больного в графе
"Мониторинг".
--------------------------------
<*> Указанная форма лабораторного журнала используется в
лабораторной практике по рекомендации ВОЗ.
Приложение 3.4
Форма для оценки работы лаборатории
по бактериоскопическому исследованию на туберкулез
при проведении внешнего контроля качества
Название и адрес лаборатории
____________________________________________________________________
Дата оценки работы лаборатории "____" __________ 200__ г.
Общие аспекты
Страницы: | Стр.1 | Стр.2 | Стр.3 | Стр.4 |
| 
