Стр. 3
Страницы: | Стр.1 | Стр.2 | Стр.3
7. Арендит 0,64 - катализатор, Serva;
8. Дибутилдифтолат - пластификатор, Serva;
9. Уранил ацетат, Serva
10. Цитрат свинца, Serva
11. Тотрат калия, Serva
12. Едкий натр (NaOH) (ГОСТ 4328-77)
13. Натрий фосфорнокислый (NaHPO4 и Na2НРО4 х 2Н20) (ГОСТ 4172-76)
14. Тетраоксид осмия OsO4 (О5500, Sigma)
Приготовление растворов
Все растворы готовятся на бидистиллированной воде.
1. 70% этанол (100 мл 96 град. этанола + 28 мл Н2О).
2. 100% этанол хранится в посуде с селикогелем или получают из 96 град. этанола путем обезвоживания (100 мл 96 град. этанола + 20 г CuSO4 х 5Н2О, прожженного при 100 град. С в течение 30 - 40 мин).
3. 2,5% глутаральдегид (10 мл 25% глутаральдегида + 90 мл фосфатного буфера).
4. Смесь аралдитов. Равные объемы (20 мл) аралдита 964 и аралдита 212 тщательно перемешивают, предварительно нагрев до 60 град., добавляют 0,8 мл аралдита 964 и 1,2 мл дибутилфтолата и вновь тщательно перемешивают в течение 20 - 30 минут.
5. 5% уранил ацетат (0,5 мл уранил ацетата + 7 мл метанола + 3 мл Н2О).
6. Раствор цитрата свинца (40 мг NaOH растворить в 10 мл Н2О + 20 мл тортрата калия + 40 мг цитрата свинца).
7. 1% тетраоксид осмия (1,3 г тетраоксида осмия растворить в 50 мл Н2О и хранить в темном месте). Перед употреблением добавить 50 мл фосфатного буфера.
8. Фосфатный буфер pH 7,2 (28 мл 0,2 М NaH2РО4 + 72 мл 0,2 М Na2НРО4).
Приложение 17
к Инструкции по диагностике
губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота
ОБОРУДОВАНИЕ, РЕАКТИВЫ И ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАСТВОРОВ
ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ГУБКООБРАЗНОЙ ЭНЦЕФАЛОПАТИИ КРУПНОГО
РОГАТОГО СКОТА МЕТОДОМ ИММУНОБЛОТИНГА
Оборудование
1. Автоматические пипетки с переменным объемом на 1 мл, 0,2 мл и 0,02 мл
2. Наконечники к пипеткам 1 мл и 0,2 мл
3. Пластиковые центрифужки одноразового применения на 1,5 мл
4. Центрифуга настольная типа ОПН-8
5. Центрифуга лабораторная типа ЦЛР
6. Холодильник бытовой с морозильной камерой -18 град. С ("Минск-15")
7. Лабораторная посуда
8. pH-метр
9. Источник тока (ПЭФ-3, УИП-2)
10. Прибор для вертикального электрофореза
11. Герметичные коробки для фиксации и окраски гелей
12. Прибор для переноса белков с ДСН-ПААГ на нитроцеллюлозные мембраны
13. Герметичные коробки для обработки нитроцеллюлозных мембран
14. Целлофановая пленка
15. Фильтровальная бумага
16. Термостат
17. Водяная баня
18. Весы технические 10 - 200 г
19. Весы аналитические
20. Аппарат для встряхивания АВЧ-6С (РФ)
Реактивы
1. Трис-(гидрооксиметил)-аминометан (ТУ 6-09-4292-76)
2. HCl концентрированная (ГОСТ 3118-77)
3. Глицин (ГОСТ 5860-75)
4. Акриламид (ТУ 6-09-14-1576-73)
5. Метиленбисакриламид (ТУ 6-09-10-1234-77)
6. Додецилсульфат натрия (ТУ 6-09-06-805-76)
7. Аммония персульфат (ГОСТ 20478-75)
8. TEMED (N,N,N,N-тетраметилэтилендиамин) (T9281, Sigma)
9. Бромфеноловый синий (ТУ11П-282-71; ТУ 6-09-4530-77)
10. В-меркаптоэтанол (ТУ 6-09-08-1024-75)
11. Глицерин (ГОСТ 6259-75)
12. Мочевина (ГОСТ 6691-77)
13. Этиловый спирт C2H5OH (ГОСТ 18300-87)
14. Уксусная кислота ледяная (ГОСТ 61-75)
15. Глицерин (ГОСТ 6259-75)
16. Амидо черный 10В (N3393, Sigma)
17. Мембрана нитроцеллюлозная "Миллипор"-НА (Франция, "Schleicher & Schuell" ВАД-0,45 мкм; ФРГ, ВА-85-0,45 мкм)
18. Твин-20 (P7949, Sigma)
19. Бычий сывороточный альбумин (A2153, Sigma)
20. 3,3'-диаминобензидин тетрагидрохлорид (D7304, Sigma)
21. Моноклональные антитела к иммуноглобулинам крупного рогатого скота, меченные пероксидазой хрена
22. Положительные и отрицательные контрольные сыворотки
Приготовление растворов
Все растворы готовят на бидистиллированной воде.
1. Раствор мономеров: 45 г акриламида; 1,2 г N,N-метиленбисакриламида и 0,15 г ДСН растворяют в 105 мл Н2О, фильтруют.
2. Буфер для разделительного геля: 13,6 г трис, 0,2 г ДСН растворяют в 180 мл Н2О, доводят концентрированной HCl до pH 8,8, объем доводят H2О до 200 мл.
3. Буфер для фокусирующего геля: 1,68 г трис, 0,1 г ДСН растворяют в 90 мл Н2О, доводят концентрированной HCl до pH 6,8 (осторожно) и доводят H2О до 100 мл.
4. Электродный буфер, 10-кратный: 144 г глицина, 10 г ДСН растворяют в 900 мл Н2О, доводят сухим трисом (10 г) до pH 8,3 и общий объем - до 1 л.
5. Лизирующий буфер: 10 мл буфера для фокусирующего геля (pH 6,8), 5 мл - b-меркаптоэтанола, 2 г ДСН и 5 мл Н2О. Лизирующий буфер добавляют к пробе в количестве 1/4 от объема образца.
6. Маркерная краска: 200 мг "бромфенолового голубого" растворяют в буфере для образца, добавляют 50 мг глицерина, объем доводят до 100 мл.
7. Буфер для образца: 0,84 г трис растворяют в 90 мл Н2О, доводят концентрированной HCl до pH 6,8 и Н2О до 100 мл.
8. Разделительный гель. Для приготовления 10% разделительного геля смешивают 10 мл раствора мономеров, 20 мл буфера для разделительного геля (для приготовления 12% разделительного геля берут соответственно 12 мл и 18 мл). Добавляют 0,015 мг персульфата аммония и 0,075 мл TEMED в разведении 1/10. Смесь перемешивают и заливают в пластину для электрофореза. Сверху осторожно наслаивают 1 мл дистиллированной воды и оставляют при комнатной температуре. О завершении полимеризации геля судят по появлению четкого раздела между гелем и водой. После завершения полимеризации воду сливают и поверхность геля осторожно осушают фильтровальной бумагой.
9. Фокусирующий гель, 5%. Смешивают 1,5 мл раствора мономеров и 9 мл буфера для фокусирующего геля, добавляют 6 мг персульфата аммония и 0,05 мл TEMED в разведении 1/10.
10. Буфера для переноса:
буфер А: 0,3 М трис pH 10,4;
буфер Б: 25 мМ трис pH 10,4;
буфер В: 40 мМ аминокапроновая кислота, 25 мМ трис pH 9,4.
11. Трис-буфер pH 7,4 (ТБ), 10-кратный сток-раствор: 6,05 г трис, 0,5 г азида натрия и 45 г хлористого натрия. Растворяют в 400 мл H2О, доводят pH до 7,4 концентрированной HCl. Доводят объем буфера до 500 мл.
12. Промывочный буфер. Смешивают 10 мл 10-кратного сток-раствора ТБ и 90 мл H2О. Добавляют 50 мкл Твин-20, перемешивают.
13. Блокирующий раствор: 1 г БСА растворяют в 50 мл H2О, добавляют эмбриональную сыворотку 10 мл и 10 мл 10-кратного ТБ. Объем доводят до 100 мл H2О, перемешивают.
14. Раствор субстрата: 10 мл 10-кратного ТБ и 90 мл H2О. Вносят 30 мг бензидина, смесь нагревают на водяной бане до полного растворения диаминобензидина, охлаждают до комнатной температуры и добавляют 0,1 мл 30% H2О2. Раствор субстрата готовят непосредственно перед использованием.
Приложение 18
к Инструкции по диагностике
губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота
НЕГНОЙНЫЙ ЭНЦЕФАЛИТ
***** НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ
Диффузная инфильтрация круглоклеточными элементами
нейроглии, сглаживание структуры мозга, вакуолизация
отсутствует (окраска гематоксилинэозином, 300x)
Приложение 19
к Инструкции по диагностике
губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота
НЕГНОЙНЫЙ ЭНЦЕФАЛИТ
***** НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ
Диффузная инфильтрация круглоклеточными элементами
нейроглии, сглаживание структуры мозга, вакуолизация
отсутствует (окраска гематоксилинэозином, 600x)
Приложение 20
к Инструкции по диагностике
губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота
БЕШЕНСТВО
***** НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ
Наличие в аммоновом рогу патогномоничных оксифильных
(красных) округлых телец Бабеша-Негри (окраска по
Муромцеву, 600x)
Приложение 21
к Инструкции по диагностике
губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота
ГНОЙНЫЙ ЭНЦЕФАЛИТ ПРИ ЛИСТЕРИОЗЕ
***** НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ
Цитокариопикноз и лизис нейронов, диффузная инфильтрация
нейроглии лимфоидными и частично нейтрофильными
элементами (окраска гематоксилинэозином, 300x)
Приложение 22
к Инструкции по диагностике
губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота
ГНОЙНЫЙ ЭНЦЕФАЛИТ ПРИ ЛИСТЕРИОЗЕ
***** НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ
Цитокариопикноз и лизис нейронов, диффузная инфильтрация
нейроглии лимфоидными и частично нейтрофильными элементами
(окраска гематоксилинэозином, 300x)
Приложение 23
к Инструкции по диагностике
губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота
АДЕНОМАТОЗ ОВЕЦ
***** НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ
Метаплазия альвеолярного эпителия в виде онкоподобных
аденом на фоне расплавления межальвеолярных перегородок
и образования эмфизематозных полостей (окраска
гематоксилинэозином, 300x)
Приложение 24
к Инструкции по диагностике
губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота
ВИСНА ОВЕЦ
***** НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ
Патогномоничный периваскулярный инфильтрат
крупноклеточных элементов в стволовой части
продолговатого мозга (окраска гематоксилинэозином,
300x)
Приложение 25
к Инструкции по диагностике
губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота
СКРЕПИ ОВЕЦ
***** НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ
Кариопикноз, каогуляция и пониженная оксифилия
цитоплазмы нейронов (окраска гематоксилинэозином, 300x)
Приложение 26
к Инструкции по диагностике
губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота
СКРЕПИ ОВЕЦ
***** НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ
Цитокариолизис нейронов (окраска гематоксилинэозином, 300x)
Приложение 27
к Инструкции по диагностике
губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота
СКРЕПИ ОВЕЦ
***** НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ
Хроматолизис ядра и вакуолизация цитоплазмы нейронов
(окраска гематоксилинэозином, 300x)
Приложение 28
к Инструкции по диагностике
губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота
СКРЕПИ ОВЕЦ
***** НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ
Лизис цитоплазмы и оттеснение остатков ядра к периферии
нейрона. Характерный патогномоничный признак -
перстневидный нейрон (окраска гематоксилинэозином, 300x)
Приложение 29
к Инструкции по диагностике
губкообразной энцефалопатии
крупного рогатого скота
МЕДИ ОВЕЦ
***** НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ
Пролиферация круглоклеточных элементов в
интерситициальной ткани легких, перибронхит,
расплавление межальвеолярных перегородок и образование
эмфиземоподобных полостей (окраска гематоксилинэозином, 300x)
Страницы: | Стр.1 | Стр.2 | Стр.3
| 
