|
|
|
|
Навигация
Новые документы
Реклама
Ресурсы в тему
|
Приказ Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 24.06.1997 № 154 "О дальнейшем совершенствовании системы контроля качества клинических лабораторных исследований"Документ утратил силу
< Главная страница Зарегистрировано в НРПА РБ 20 августа 2001 г. N 8/6752 Лабораторные клинические исследования представляют собой комплекс специальных аналитических методов, направленных на исследование биологического материала. Как с аналитической, так и с клинической точек зрения, клинические лабораторные исследования для обеспечения преемственности результатов исследований на всей территории Республики требуют обязательного наличия строгого контроля правильности и воспроизводимости выполняемых исследований, охватывающего все клинико-диагностические лаборатории. В то же время постоянный контроль правильности работы клинико-диагностических лабораторий обеспечивает наиболее экономное расходование средств на лабораторное исследование, предупреждая затраты на повторные исследования. Республиканским центром клинической лабораторной диагностики проведена значительная работа как по совершенствованию инфраструктуры клинических лабораторных исследований, так и по развитию системы контроля качества. Значительно расширился спектр самих методик, изменились методические подходы в исследованиях, осуществляется регулярный внутри- и межлабораторный контроль качества как на республиканском, так и на региональном (областные контрольные центры) уровне, налажена система постоянно действующих рабочих республиканских и региональных семинаров по итогам контроля качества. В целях закрепления достигнутых результатов и дальнейшего совершенствования контроля клинических лабораторных исследований УТВЕРЖДАЮ: 1. Методические указания "Контроль качества клинических лабораторных исследований" (приложение 1). 2. Положение о порядке проведения внутрилабораторного контроля качества в клинико-диагностических лабораториях (приложение 2). 3. Положение о порядке проведения межлабораторного контроля качества в клинико-диагностических лабораториях, который организуется в Республиканском центре клинической лабораторной диагностики (РЦКЛД) (приложение 3). ПРИКАЗЫВАЮ: 1. Руководителям лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ) - обеспечить выполнение системы внутрилабораторного контроля качества, в соответствии с приложением 2. 2. Руководителю РЦКЛД Костину Г.М.: 2.1. обеспечить выполнение системы межлабораторного контроля качества, в соответствии с приложением 3; 2.2. до 1 июля 1997 г. представить предложения по совершенствованию материально-технической базы республиканской и региональных систем контроля качества клинических лабораторных исследований; 2.3. до 1 сентября 1997 г. представить предложения по формированию референтных лабораторий по всему спектру клинических лабораторных исследований; 2.4. ежегодно, до 15 января, представлять отчет о результатах межлабораторного контроля качества в Главное управление медицинской помощи Министерства здравоохранения (МЗ). 3. Комиссии по определению первоочередных закупок за счет централизованных средств Минздрава предусматривать закупку для клинико-диагностических лабораторий контрольных материалов и стандартов для целей внутри- и межлабораторного контроля качества, в соответствии с ежегодными заявками РЦКЛД. 4. Приказ разрешается размножить и довести до подведомственных учреждений. 5. Контроль за исполнением приказа возложить на Первого заместителя Министра Ореховского В.М. Министр И.Б.ЗЕЛЕНКЕВИЧ Приложение 1 I. ВВЕДЕНИЕПроведение контроля качества (КК) клинических лабораторных исследований является неотъемлемой частью работы каждой клинико-диагностической лаборатории (КДЛ) лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ). Осуществление КК в КДЛ позволяет предупредить и устранить ошибки, повысить точность и диагностическую надежность результатов анализа, обеспечить преемственность в анализах между различными лечебными учреждениями, что, в свою очередь, способствует уменьшению нагрузки лабораторий, количества дублируемых исследований и экономических затрат на производство анализов. Расширение диапазона исследований и усложнение лабораторных тестов, внедрение все более сложных измерительных приборов и средств механизации лабораторного труда не исключают возможностей возникновения ошибок и требуют контроля исследований. Лабораторные ошибки влияют на установление правильности диагноза и лечения обследуемого, определение сроков выздоровления и прогноза заболевания, а нередко решают и исход болезни. Использование методов контроля дает возможность оценить качество проводимых лабораторных исследований, выявить возникающие при исследовании всевозможные ошибки, их характер и причины, выработать способы устранения ошибок. Контроль исследований обеспечивает хорошую воспроизводимость и правильность результатов анализа на протяжении всего периода работы лаборатории. Таким образом, под контролем качества работы КДЛ понимают систему мер, направленных на количественную оценку точности, сходимости, воспроизводимости и правильности лабораторных исследований. КК должен проводиться на всех этапах выполнения анализа - от получения материала и подготовки пациента к исследованию до выдачи результата анализа и его интерпретации. Контроль качества должен быть объективным, ежедневным, охватывать все лабораторные тесты и все области измерения, как нормальные, так и патологические результаты. Основная цель программы контроля лабораторных показателей - выявить и устранить ошибки. В аналитической лаборатории надежность исполнения правильности анализов гарантируется путем: - постоянного наблюдения за вариабельностью аналитических процессов; - исправления чрезмерной вариабельности; - оценки результатов измерения согласно определенным критериям; - документации всех этих действий. В обязанности врача-лаборанта по КК входит также оказание методической помощи сотрудникам КДЛ по приготовлению стандартов, построению калибровочных графиков, расчетов, составлению таблиц и их проверке. II. ВОЗМОЖНЫЕ ИСТОЧНИКИ ОШИБОКИмеется определенная степень ненадежности в каждом лабораторном измерении, как при ручных исследованиях, так, в какой-то мере, и при автоматизированных. Можно выделить доаналитические, аналитические и постаналитические факторы погрешностей. Ошибки обычно разделяют на две основные группы: 1. Внелабораторные. 2. Лабораторные. Доаналитические (внелабораторные) ошибки составляют около 20% всех ошибок. Их подразделяют на основные группы: - канцелярские ошибки; - ошибки, связанные с состоянием пациента и его подготовкой к исследованию; - ошибки взятия проб; - хранения биологического материала; - хранения и чистоты реактивов, инструментов и посуды, необходимых для взятия биологического материала. Канцелярские ошибки включают в себя ошибочных больных, ошибочные образцы, перепутывание фамилий больных или их кодирующих номеров, бланков-заказов, ошибочные заявки и прочие. При взятии крови частой причиной искажения лабораторных анализов является гемолиз крови. В гемолизированных сыворотках завышаются результаты определения железа, калия, билирубина, холестерина, активности ферментов (лактатдегидрогеназы, кислой и щелочной фосфатаз, альдолазы и др.). К лабораторным погрешностям может привести неправильно подобранный антикоагулянт. Так, цитрат и оксалат натрия ингибируют большинство ферментов, ЭДТА ингибирует активность щелочной и кислой фосфатаз, гепарин активирует постгепариновую липазу, расщепляющую хиломикроны, и не может использоваться для получения плазмы на исследование показателей липидного обмена, а также для исследования коагулограммы, являясь физиологическим антикоагулянтом. При взятии крови на коагулограмму необходимо точное соотношение антикоагулянта и крови, иначе при увеличении количества цитрата натрия выявляется ложная гипокоагуляция, а при уменьшении - происходит процесс свертывания крови и образование фибриновых сгустков. При определении групп крови могут возникать как технические ошибки, связанные с нарушением инструкции (температурный режим, чистота посуды, нанесение сывороток на плоскость, соотношение крови и стандартной сыворотки, время учета реакции и т.п.), так и ошибки, зависящие от качества стандартных реагентов. Кроме того, бывают ошибки, связанные с особенностями исследуемой крови: а) неправильное определение групп А и АВ; б) неспецифическая агглютинация эритроцитов при онкологических заболеваниях, гиперфибриногенемиях, гипергаммаглобулинемиях, наличии аутоантител к эритроцитам и др.); в) наличие в сыворотке крови лиц с группами А и АВ экстрааглютинина альфа-1. Скорость оседания эритроцитов (СОЭ) у пациентов с разными заболеваниями меняется в довольно значительных пределах (от 10-12 до 50-60 мм/ч), имея существенное неспецифическое клиническое значение. На величину СОЭ оказывают выраженное влияние три группы факторов: 1. Состояние эритроцитов (количество клеток, их размеры - макро, микроциты, состояние мембраны эритроцитов, заряд мембраны). 2. Состав плазмы крови (повышенная концентрация белков острой фазы, гиперглобулинемия, гиперфибриногенемия). 3. Технические факторы (диаметр и длина капилляра, положение капилляра, вибрация, температура, световая и магнитная радиация, время седиментации, избыток антикоагулянта). Эти факторы необходимо учитывать при постановке и оценке СОЭ. К ошибкам может привести неучет времени приема и качество пищи пациентов. Липемия искажает результаты не только показателей липидного обмена, но также и общего белка, билирубина, активности ферментов и др. В течение суток (суточные, циркадные ритмы) имеются колебания таких параметров как хлориды, фосфор, креатинин, азот мочевины, общие липиды, железо, общий белок, глюкокортикоиды (табл.1). Таблица 1 Колебания некоторых параметров в разное время суток----+-------------+----------------+---------------+------------- ¦ ¦Анализируемый¦ 7-10 час. ¦ 10-14 час. ¦ После 14 час. ¦ ¦ N ¦ компонент, ¦ _ _ ¦ _ _ ¦ _ _ ¦ ¦п/п¦ ммоль/л ¦ Х+-хS ¦ Х+хS ¦ Х+хS ¦ ¦ ¦ ¦ V% ¦ V% ¦ V% ¦ +---+-------------+----------------+---------------+-----------------+ ¦1. ¦Хлориды ¦ 101,54+-1,27 ¦ 101,75+-1,49 ¦ 102,28+-1,41 ¦ ¦ ¦ ¦ 1,27 ¦ 1,47 ¦ 1,38 ¦ +---+-------------+----------------+---------------+-----------------+ ¦2. ¦Фосфор ¦ 3,56+-0,30 ¦ 3,71+-0,34 ¦ 2,93+-0,21 ¦ ¦ ¦ ¦ 8,30 ¦ 9,28 ¦ 7,41 ¦ +---+-------------+----------------+---------------+-----------------+ ¦3. ¦Креатинин ¦ 0,88+-0,10 ¦ 1,03+-0,07 ¦ 1,12+-0,09 ¦ ¦ ¦ ¦ 10,86 ¦ 6,37 ¦ 8,17 ¦ ¦---+-------------+----------------+---------------+------------------ Изменяются биохимические показатели крови и в разные периоды года (сезонные ритмы, табл.2). Таблица 2 Сезонные изменения уровня некоторых липидов крови у доноров (Крыжановский В.Л., 1974)--------+--------------------------+----------------------------- ¦ N ¦ ¦ Время года ¦ ¦ п/п ¦ Показатели +--------------+------------------+ ¦ ¦ ¦ осень ¦ зима ¦ +-------+--------------------------+--------------+------------------+ ¦ 1. ¦Общий холестерин, ммоль/л ¦ 4,59+-0,313 ¦ 7,085+-1,001 ¦ +-------+--------------------------+--------------+------------------+ ¦ 2. ¦Холестерин в ¦ 2,69+-0,149 ¦ 3,94+-0,147 ¦ ¦ ¦бета-липопротеинах, ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ммоль/л ¦ ¦ ¦ +-------+--------------------------+--------------+------------------+ ¦ 3. ¦Свободный холестерин, ¦ 1,895+-0,198 ¦ 3,135+-0,153 ¦ ¦ ¦ммоль/л ¦ ¦ ¦ +-------+--------------------------+--------------+------------------+ ¦ 4. ¦Свободные жирные кислоты, ¦ 0,493+-0,032 ¦ 0,556+-0,047 ¦ ¦ ¦г/л ¦ ¦ ¦ +-------+--------------------------+--------------+------------------+ ¦ 5. ¦Триацилглицерины, ммоль/л ¦ 2,087+-0,0935¦ 1,614+-0,0913 ¦ +-------+--------------------------+--------------+------------------+ ¦ 6. ¦Бета-липопротеины, г/л ¦ 4,21+-0,169 ¦ 4,03+-0,228 ¦ ¦-------+--------------------------+--------------+------------------- Необходимо унифицировать время забора биологического материала, исследовать кровь, взятую натощак во избежание возникновения источников погрешностей указанного рода. Волнение и страх перед взятием крови могут повлиять на показатели гормонального статуса, глюкозы, калия и др. Физическая нагрузка приводит к сдвигам значений активности ферментов. Курение прежде всего искажает результаты исследования показателей липидного обмена. Проблема медикаментозных влияний на результаты лабораторных исследований становится все более актуальной. Лекарственные вещества оказывают влияние на лабораторные показатели разными путями: - изменяют интенсивность болезненного процесса; - оказывают побочное действие на деятельность различных органов и систем; - интерферируют с определенными веществами в процессе лабораторного исследования. Химическая и физическая интерференция является частой причиной ошибочных результатов при исследовании биологических проб. Результаты лабораторных исследований нередко изменяют не сами лекарственные вещества, а их промежуточные или конечные продукты. Обнаружены достоверные изменения таких показателей как билирубин, креатинин, калий, щелочная фосфатаза, аланинаминотрансфераза после приема больших доз аскорбиновой кислоты. Поэтому собирать материал для исследования необходимо до начала приема лекарственных препаратов, а также до проведения диагностических и лечебных процедур. Так, активность КК, ЛДГ, АсАТ увеличивается после катетеризации сердца, частых внутримышечных инъекций, КФ - после ректального исследования и массажа предстательной железы. Не рекомендуется брать кровь для гематологических исследований после физиопроцедур и рентгеновского облучения, после физических и умственных нагрузок. Не следует производить взятие крови на реакцию Вассермана у лихорадящих больных, после приема алкоголя, общего наркоза, обширных травм, хирургических вмешательств, приема наркотических препаратов и препаратов наперстянки. Следует также иметь в виду, что следы детергентов в стеклянных пробирках влияют на исследование активности ферментов, показателей липидного обмена (холестерина, фосфолипидов). Использование вместо стеклянных пробирок одноразовых пластмассовых позволяет избегать указанных недостатков. Весьма существенной причиной возникновения погрешностей анализа является нарушение условий хранения проб. Длительное стояние сыворотки над эритроцитами приводит к сдвигам концентрации ряда показателей (табл.3). Таблица 3 Изменение некоторых биохимических компонентов сыворотки крови после продолжительного контакта ее со сгустком крови--------+--------------------------+----------------------------- ¦ N ¦ ¦ Время (часы) ¦ ¦ п/п ¦ Компоненты +-------------+-------------------+ ¦ ¦ ¦ 24 ¦ 48 ¦ +-------+--------------------------+-------------+-------------------+ ¦ 1. ¦Глюкоза ¦ -30% ¦ -50% ¦ +-------+--------------------------+-------------+-------------------+ ¦ 2. ¦Лактатдегидрогеназа ¦ +30% ¦ +40% ¦ +-------+--------------------------+-------------+-------------------+ ¦ 3. ¦Калий ¦ +25% ¦ +52% ¦ +-------+--------------------------+-------------+-------------------+ ¦ 4. ¦Железо ¦ +8% ¦ +17% ¦ +-------+--------------------------+-------------+-------------------+ ¦ 5. ¦Трансаминазы ¦ -8%-9% ¦ -12% ¦ +-------+--------------------------+-------------+-------------------+ ¦ 6. ¦Щелочная фосфатаза ¦ -2% ¦ -4% ¦ ¦-------+--------------------------+-------------+-------------------- Некоторые вещества чувствительны к влиянию ультрафиолетовых лучей (например, билирубин), поэтому пробы нельзя держать на свету. Время стояния сыворотки над сгустком крови или плазмы над эритроцитами должно строго ограничиваться (не более 1 ч после взятия крови). При необходимости сохранить сыворотку на 2-3 месяца ее следует заморозить при Т -20 град. С -70 град. С и хранить, избегая оттаивания. Проведение бактериологических исследований часто сопровождается ошибками, связанными с забором материала. Взятие материала может быть нестерильным или он взят из неинфицированного очага. Могут быть нарушены условия доставки исследуемого материала (продолжительная транспортировка, большой промежуток времени от забора до посева), неправильная техника посева, нарушение технологии приготовления питательных сред или некачественные среды. Иногда нарушаются условия культивирования в термостате, а также неправильная идентификация возбудителей микробов, связанная с постановкой метода или учетом результата. При целевом исследовании отрицательный ответ может быть обусловлен рядом приведенных причин. Для проведения КК бактериологических исследований используется специальный материал (специальные культуры). Иммунологические показатели у здоровых людей характеризуются индивидуальностью значений, возрастными изменениями и колебаниями под влиянием биологических ритмов и нагрузочных факторов. Подобной изменчивостью характеризуются и иммунологические параметры больных. Чтобы получить максимальную информацию от иммунограммы, необходимо знать индивидуальную иммунологическую норму пациента, проводить оценку всех показателей и их соотношений с учетом клинической картины заболевания и в динамике. В подавляющем большинстве случаев анализ иммунограммы дает возможность делать ориентировочные, а не безусловные выводы диагностического и прогностического характера. При подготовке к исследованию общеклинического анализа мочи особых ограничений в рационе не требуется. Важным является правильность сбора мочи. Необходимо воздержаться от большого количества моркови, свеклы, а также от приема мочегонных средств, амидопирина, настоев или отваров трав. За сутки до исследования не следует менять питьевой режим. Мочу собирают в сухую, чистую стеклянную посуду утром. Для определения количественного содержания глюкозы в суточной моче ее первая утренняя порция (после пробуждения) выливается. Затем пациент собирает в чистую трехлитровую банку все порции мочи в течение суток, включая и порцию мочи, выделенную утром следующего дня. Измерив общее количество и перемешав ее, пациент относит в лабораторию 100 мл мочи для исследования. При исследовании концентрационной функции почек по методу Зимницкого мочу в течение суток через каждые три часа собирают в отдельные, заранее подготовленные и подписанные банки (8 банок на 8 порций мочи). Мочегонные средства применять нельзя. Для исследования мочи по методу Нечипоренко с количественным подсчетом клеток собирается средняя порция утренней мочи (в середине мочеиспускания). Исследование мочи по методу Аддис-Каковского требует ограничения суточного приема жидкости (чай, молоко, 1-е блюда, компот, вода) до 1 литра. Больной должен меньше пить днем и совсем не пить ночью. Собирают мочу, выделенную вечером и ночью за 12 часов. Больной вечером опорожняет мочевой пузырь и отмечает время. Через 12 часов он мочится в чистую стеклянную посуду. Если у него возникают позывы к мочеиспусканию ночью, то он собирает мочу в ту же банку, отмечая время. Хранить мочу следует в прохладном месте. При длительном хранении изменяются физико-химические свойства мочи, разрушаются клеточные элементы осадка. В случае сбора суточного количества мочи используют консерванты (кристаллы тимола, хлороформенную воду и др.). Для цитологических исследований мокрота не должна стоять более 4 часов с момента получения, так как при более длительном хранении происходит аутолиз элементов. Спинномозговая жидкость доставляется в лабораторию сразу же после пункции. При невозможности непосредственного исследования кала, его сохраняют в стеклянной посуде в закрытом виде в холодильнике. Условия транспортировки биопроб могут оказать определенное влияние на точность получаемых результатов исследования. Во время транспортировки следует оберегать пробы от сильного встряхивания и перегрева. Нередко источники погрешностей не поддаются качественному контролю. Необходимо помнить о важности регулярного инструктирования персонала клиник и амбулаторий о правилах и условиях забора, а также хранения биологического материала для различных клинико-диагностических исследований и подготовки пациента к исследованию. III. ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЕ ИСТОЧНИКИ ОШИБОКНадежность результатов исследования при производстве анализов в лаборатории зависит от целого ряда факторов. Выполнение анализов, правильное в качественном отношении, гарантируется эффективным использованием всех элементов, составляющих измерение, т.е. - оборудование - оснащение - методы - реактивы - стандарты - пробы - система контроля качества. Внутрилабораторные ошибки часто связаны с приготовлением стандартов, калибровкой прибора, расчетами, приготовлением образца, чистотой и качеством реагентов, их хранением, состоянием измерительной аппаратуры и ее энергообеспечения. Ошибки зависят от метода и техники исследования, интерпретации результатов, квалификации исполнителя. При выполнении исследования вручную большой процент ошибок связан с пипетированием, при этом лаборанты допускают индивидуальные грубые ошибки, как при взятии биологического материала, так и реагентов. Перед отбором сыворотки, мочи и других проб необходимо их тщательно, но без встряхивания перемешать. Эти факторы непосредственно зависят от лаборанта. Если пробы или реагенты были заморожены, то перед анализом образцы и реагенты следует согреть до комнатной температуры. Обычно на это требуется около часа. Перед исполнением анализа тщательно перемешать образцы проб и реагентов, не допуская чрезмерного пенообразования и микробиологического загрязнения. Работа с эталонированными пипетками дает меньше погрешностей, чем с обычными. Обычные пипетки нередко не точные по объему, а при работе дозаторами может быть плохо подогнана насадка (наконечник). К ошибке может привести висячая капля на пипетке, неполный забор дозатором и его физический износ. Существенным источником погрешностей является обработка стандарта. Стандартное вещество должно быть химически чистым (х.ч.), точно взвешено на аналитических весах, растворено в мерной калиброванной посуде. При возможности следует предпочитать стандарты, содержащие белок. Стандарты - это основа точных анализов. Единичное калибрование не является надежным, поэтому анализированию необходимо подвергать стандарты с разной концентрацией вещества. Если в лаборатории используются дозаторы, то и стандартное вещество обрабатывается также дозаторами. Реактивы в лабораториях должны приготавливаться с большой точностью, быть чистыми, обозначены после приготовления и храниться согласно предписаниям. Одной из причин погрешностей в работе может быть использование реактивов с истекшим сроком годности. Вода, употребляемая для приготовления реагентов, должна быть также хорошего качества (иметь pH близкий к нейтральной реакции, не содержать примесей солей и т.п.). Чтобы исключить методические погрешности, необходимо пользоваться унифицированными (стандартизированными) методами исследований. Иногда ошибка может быть заложена в самом принципе метода. Так, при определении активности КФ с 4-нитрофенилфосфатом калий-натрий тартрат наряду с простатическим изоферментом КФ определяет и изофермент КФ эндометрия и, таким образом, у женщин выявляется ложнопростатическая форма КФ. Важным фактором является также качество оборудования и оснащения в лаборатории, стабильность энергообеспечения и температурного режима. Состояние измерительной аппаратуры должно периодически проверяться. В идеальном случае при фотометрическом измерении между значением концентрации вещества и экстинкцией (оптической плотностью) прибора соблюдается линейная зависимость (закон Ламберта-Бугера-Бэра). Ошибки будут тем больше, чем больше разница между концентрацией стандарта и анализируемой пробой. Особенно указанное правило становится важным при выполнении сложных анализов в большом интервале концентраций. Надежность результатов измерений при работе на приборах в КДЛ, в первую очередь, обеспечивается правильной установкой и соответствующей эксплуатацией приборов, их техническим обслуживанием. Приступать к измерениям можно только после тщательного ознакомления с устройством прибора и правилами его эксплуатации. Проверка приборов производится органами метрологической службы, в ведении которых находятся поверочные средства, и лицами, имеющими допуск (сертификат) к данной аппаратуре, а также представителем фирмы-производителя данной аппаратуры. Если в лаборатории имеются калибраторы, то прибор калибруется персоналом, работающим на данном приборе. Однако, это не исключает метрологической поверки прибора. Немаловажное значение для правильности исследований имеет чистота лабораторной посуды. Пробирки и измерительные кюветы должны быть химически чистыми, сухими. Для гарантии оптимальных условий работы лаборатория должна быть оснащена хорошей вентиляцией и кондиционерами. Из суммы всех перечисленных погрешностей получается интегральная ошибка, выражающаяся в неточности конечного результата. IV. КЛАССИФИКАЦИЯ АНАЛИТИЧЕСКИХ ОШИБОКНаиболее распространена следующая классификация аналитических ошибок: - грубые; - случайные; - систематические. Грубые ошибки - это ошибки одиночного значения, результаты исследований выходят за пределы области определяемого компонента, как нормы, так и патологии. Такие ошибки обычно замечаются сразу и отбрасываются. Эти ошибки могут быть субъективными, которые зависят от квалификации лаборанта, а также недостаточной тщательности его работы, ошибкой в разведении, подсчете, небрежностью в проведении метода исследования. Они могут быть объективными, зависящими от чистоты лабораторной посуды, реактивов, состояния приборов и др. Случайные ошибки - это ошибки также одиночного значения, нет закономерности в их появлении, они не выходят за пределы области исследуемого компонента и влияют на индивидуальные результаты исследования. Эти ошибки могут быть также субъективными и объективными. Наличие случайных ошибок сказывается в том, что при повторном определении того или иного компонента получают, как правило, не одинаковые, а несколько различающиеся между собой результаты. Такого рода ошибки обусловлены: 1. Свойствами самой пробы (гомогенностью, неравномерностью перемешивания). 2. Некачественным инструментарием (неточность пипеток, дозаторов, нестабильностью фотометров и т.д.). 3. Неточностью работы персонала (ошибка пипетирования, разведения, считывания, утомление лаборанта и т.д.). Случайные ошибки происходят при всяком измерении, в том числе при любом аналитическом определении, как бы тщательно оно не проводилось. Величина случайных ошибок (разброс данных) является мерой воспроизводимости лабораторных результатов. Чем меньше величина случайных ошибок и меньше разброс индивидуальных показателей, тем лучше воспроизводимость данных лабораторных показателей. Распространенным способом характеристики воспроизводимости результатов является величина среднеквадратического отклонения (S). Систематические ошибки - это ошибки одинаковые по знаку, т.е. результаты лабораторных исследований либо завышены, либо занижены и происходят от одинаково определенных причин. Как бы хорошо не совпадали результаты параллельных проб, т.е. были воспроизводимы, они могут быть далеки от истинного значения. В таких случаях допущены систематические ошибки. Наиболее характерными являются следующие виды систематических ошибок: 1. Ошибки методические. Они зависят от особенностей применяемого метода анализа, например, некачественно протекает реакция, влияние посторонних примесей и т.д. Поэтому колориметрические методы уступают более точным спектрофотометрическим, флуориметрическим, иммуноферментным методам. Методические ошибки составляют серьезную причину искажения результатов количественного определения. 2. Ошибки, зависящие от применяемых приборов, их состояния и реактивов (неточные весы, нечувствительность фотоэлементов, загрязнение растворов, неправильно выбранный светофильтр, сбивка длины волны, использование реагентов с истекшим сроком годности, загрязненная вода и т.п.). 3. Ошибки оперативные. Они происходят от неправильного или недостаточно тщательного выполнения аналитических операций (неточный отбор растворов, пробы, разведение, нарушение температурного режима и др.). 4. Ошибки, допущенные при обработке стандарта, построения калибровочного графика, вычислении фактора пересчета и составлении калибровочной таблицы. Для подготовки лиофилизированных стандартов перед вскрытием флаконов легким постукиванием стряхнуть частицы, прилипшие к пробке, точно добавить необходимое количество растворителя, закрыть пробку и оставить при комнатной температуре на 10 минут. Затем аккуратно перемешать содержимое флаконов, наклоняя и вращая до полного растворения вещества. Избегать сильного встряхивания и пенообразования. Растворы лиофилизатов должны быть прозрачными. Наличие мути, хлопьев, взвеси свидетельствует о непригодности вещества. Систематические ошибки влияют на всю серию определений. Величина систематической ошибки характеризует правильность результатов. Обнаружение систематической ошибки является сложной задачей. Первым и совершенно необходимым шагом в решении этой проблемы является тщательное подведение итогов ежедневной работы лаборатории. Большинство анализов, выполняемых в повседневной практической работе лаборатории, дает нормальные результаты и только небольшая часть анализов показывает патологические отклонения. Поэтому, если в один из дней все или большинство ответов при данном определении сдвинуты в какую-либо сторону, то такие данные должны натолкнуть на мысль о погрешности, общей для всей серии анализов, т.е. о систематической ошибке. Кроме того, необходима тесная связь между лабораторией и клиникой. Контакт между лаборантом и лечащим врачом оказывается весьма полезным для выявления не только случайных, но и систематических ошибок. Нередко ошибки могут возникнуть при интерпретации результатов анализа лечащим врачом. Направляя больного на исследование, врач обязан объяснить правила сбора биологического материала и соблюдение режима в дни исследования. Выбор тестов должен быть наиболее информативным для каждой конкретной патологии. Заслуживает большого внимания ведение дневника в лаборатории, в который обычно заносятся данные контрольных проб и стандартов со свежеприготовленной порцией реактивов, начало использования реактива другой квалификации, другой фирмы, данные калибровочных кривых. Сопоставление показателей позволяет критически оценить характер наблюдаемых сдвигов в результатах и дает возможность во многих случаях легко установить непосредственную причину систематической ошибки. Использование автоанализаторов постепенно уменьшает число случайных ошибок (ошибок манипуляций), но не исключает систематических ошибок. Постоянное измерение точности выполнения анализов, точности работы лабораторий, т.е. проведение контроля качества работы позволяет предупредить систематические ошибки и свести до минимума случайные ошибки. Анализы не должны уходить из-под ежедневного контроля. Контроль качества лабораторных исследований должен проводиться на всех этапах производства анализа, быть объективным, непринудительным, систематическим и охватывать все области измерений. Таким образом, система мер, направленная на количественную оценку точности, воспроизводимости и правильности лабораторных определений, является системой контроля. Сущность контроля качества лабораторных исследований состоит в сопоставлении результатов диагностических исследований проб биологических жидкостей, производимых в лаборатории с результатами исследований контрольных материалов и в измерении величины отклонения. Целью контроля качества работы клинико-диагностических лабораторий является: - устранение систематических ошибок и сведение до минимума случайных ошибок, а также достичь оптимальных стандартных условий исследования биологических жидкостей во всех КДЛ. Для этого контроль качества должен быть: - систематическим; - объективным; - охватывать все области измерения; - производиться в реальных условиях работы лаборатории с применением точно установленных методов и средств контроля. В каждой лаборатории необходимо поддерживать на должном уровне воспроизводимость, правильность и точность результатов исследования. В тех случаях, когда нет возможности поддерживать и воспроизводимость, и правильность из-за технических трудностей и приходится делать выбор между ними, то воспроизводимость можно рассматривать как более важную характеристику качества в практическом смысле, чем правильность. Пока лаборатория получает воспроизводимые результаты, решение проблемы правильности можно заменить установлением устойчивых жестких нормальных значений и при повторном исследовании будут получены сопоставимые результаты, удовлетворяющие врача-клинициста. Однако, это крайняя мера и при значительных отклонениях является нежелательной, т.к. результаты будут искажать истинную концентрацию вещества. Точность анализа в целом определяется его воспроизводимостью и правильностью и характеризуется общей ошибкой анализа, которая представляет собой сумму случайных и систематических ошибок. При оценке анализа необходимо всегда приводить обе величины, характеризующие правильность и воспроизводимость. Совершенствование деятельности лабораторной службы, осуществление внутрилабораторного и межлабораторного контроля качества биохимических, гематологических, общеклинических и других методов исследования является одной из актуальных проблем в современном обследовании пациентов. V. СИСТЕМА ВНУТРИЛАБОРАТОРНОГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙОсновной формой контроля всех видов исследований практических лабораторий является внутрилабораторный контроль качества. Он должен быть ежедневным, объективным и охватывать как нормальные, так и патологические результаты. Наиболее объективный критерий надежности работы лаборатории дает систематический контроль. Надежность результатов исследования можно охарактеризовать следующими критериями: - правильность; - точность; - чувствительность; - специфичность; - диагностическая значимость. Ответственность за качество работы в лаборатории несут все, начиная от персонала, моющего посуду, и персонала, производящего забор материала на исследование, до заведующего лабораторией. Внутрилабораторный контроль качества лабораторных исследований включает определение воспроизводимости и правильности исследований. Контроль может осуществляться с помощью способов, использующих специальные контрольные материалы или средства и ряда способов, не требующих контрольных материалов. Контрольный материал. Наиболее полно удовлетворяют всем требованиям, предъявляемым к контрольному материалу, являются контрольные сыворотки, именуемые в зависимости от их квалификации стандартными, эталонными, контрольными, калибраторами и т.п. Контрольные сыворотки могут быть лиофилизированными (сухими) или жидкими, изготовленными промышленным путем, а так же слитые сыворотки, замороженные, приготовленные непосредственно в каждой лаборатории. На упаковке промышленных сывороток указывается номер серии, количество добавляемого растворителя, условия хранения и срок годности. Виды контрольных материалов. 1. Контрольные сыворотки с известным содержанием компонентов, указанном в инструкции, используются для контроля правильности лабораторных исследований. Это сыворотки типа Сероконт-П (Россия), а также, как правило, контрольный материал всех инофирм, производящих реагенты. 2. Контрольные сыворотки с неизвестным содержанием компонентов применяются для контроля воспроизводимости лабораторных исследований. Это сыворотки типа Сероконт-В (Россия). 3. Контрольные образцы крови для контроля качества исследований на автоматических счетчиках частиц крови. 4. Контрольные образцы крови для определения концентрации гемоглобина. 5. Контрольные образцы мочи. 6. Контрольные мазки крови. 7. Стандарты жидкие для исследуемых компонентов крови. 8. Стандартный тромбопластин для коагулологических исследований. 9. Контрольная человеческая плазма с известным временем активности тромбопластина. 10. Контрольная человеческая плазма с известным временем частично активированного тромбопластина (АЧТВ). 11. Контрольная человеческая сыворотка с дефицитом определенных факторов свертывания крови (VIII, IX, XI и др.). Требования, предъявляемые к контрольным материалам, следующие: а) контрольный материал должен быть идентичен по своим физико-химическим свойствам анализируемому образцу; б) стабилен при длительном хранении и транспортировке; в) должен иметь минимальную вариабельность внутри серии; г) давать возможность контролировать весь аналитический процесс; д) быть пригодным для контроля точности и правильности, то есть, выявлять систематические и случайные ошибки. Водные растворы, несмотря на простоту изготовления, не совпадают с биологической природой исследуемой среды. Контрольный материал включается в серию однотипных исследований и производится тем же персоналом, с использованием той же аппаратуры, методов, реактивов, пипеток, дозаторов и т.д. Применение контрольных материалов с известным содержанием компонентов определяет правильность выдаваемых результатов. Результат исследования контрольного материала с известным содержанием компонентов должен укладываться в пределы допустимых отклонений, указанных в инструкции (паспорте) к контрольному материалу. Если результат выходит за пределы допустимого отклонения, то показатели исследований сывороток пациентов являются неправильными, необходимо установить и устранить причину полученной ошибки. Например, в контрольной сыворотке содержание глюкозы составляет 7,6-8,4 ммоль/л. В лаборатории получен результат 6,11 ммоль/л. Следовательно, в этот день допущена ошибка, т.е. результаты глюкозы занижены. Наиболее подходящими для контроля являются нормальные и патологические контрольные сыворотки, изготовленные промышленным путем. При отсутствии промышленных сывороток можно приготовить в лаборатории слитую сыворотку (остатки сывороток после исследования сливают в одну емкость, исключая желтушные, липемические, мутные, инфицированные сыворотки, замораживают. Собирают не менее 1 литра, затем размораживают, фильтруют, разливают в стерильные флаконы и запаивают). Такие сыворотки используют для контроля воспроизводимости основных биохимических показателей - общего белка, глюкозы, холестерина, мочевины и др. Для проведения контроля правильности исследуют три контрольных кона: - с нормальными величинами; - с низкими значениями; - с высокой концентрацией вещества. Контрольные материалы не могут применяться в роли калибраторов. Калибратор всегда имеет точно определенную величину, установленную производителем или потребителем референтного метода. Эту величину надо воспринимать как надежную. Калибратор применяется для стандартизации метода или приборов. Внутрилабораторная программа контроля качества может проводиться по методам, не требующим контрольных материалов: - исследование параллельных, случайных, повторных и смешанных проб; - метод средних нормальных величин (по результатам анализов пациентов). Воспроизводимость результатов проводится при исследовании сыворотки с неизвестным, неисследованным содержанием компонентов. При этом следует учитывать, что для проведения контроля воспроизводимости необходимо располагать достаточным количеством сыворотки одной серии, чтобы ее хватило не менее чем на 6-8 месяцев работы, т.к. в разных сериях сыворотки содержится разная концентрация вещества. Внутрилабораторный контроль воспроизводимости должен проводиться в лаборатории постоянно и по всем видам анализов, его качество и эффективность оценивается межлабораторным контролем. Для контроля качества биохимических показателей крови чаще всего используют контрольные лиофилизированные сыворотки. Сухая лиофилизированная сыворотка представляет собой порошкообразное вещество золотисто-желтого цвета. На этикетке ампулы и упаковки указаны номер серии, количество добавляемого растворителя, условия хранения и срок годности. При растворении лиофилизированного материала необходимо соблюдать все требования, касающиеся работы с контрольным материалом. Сыворотка заказывается из расчета растворенного количества, т.е. в мл. На лабораторию средней мощности на год достаточно 750-1000 мл сыворотки для проведения сходимости и воспроизводимости результатов исследования. Типичными ошибками, возникающими при манипуляции с лиофилизированными контрольными образцами (сыворотка или плазма) являются: 1) потеря вещества лиофилизированной пробы при небрежном открывании пузырьков; 2) ошибки, возникающие при пипетировании растворителя; 3) недостаточное выдерживание времени, необходимого для полного растворения сыворотки; 4) сильное встряхивание; 5) несоблюдение условий хранения как сухого, так и растворенного контрольного материала. Контрольные лиофилизированные сыворотки растворяют в точно отмеренном количестве дистиллированной воды (температура 20-25 град. С), как указано на этикетке. Весь порошок материала должен быть полностью в растворе. Через 15-20 минут пузырек с сывороткой плавно наклоняют в разные стороны и оставляют до полного растворения лиофилизированной сыворотки. Время, необходимое для полного ее растворения, составляет 30-60 минут. Следует избегать образования пены в образцах, содержащих фермент или факторы свертывания крови, так как это ведет к потере активности. VI. ВНУТРЕННИЙ (ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЙ) КОНТРОЛЬ ВОСПРОИЗВОДИМОСТИКонтроль воспроизводимости результатов анализа в КДЛ подразделяется на 4 этапа: 1. Определение концентрации вещества в сыворотке типа Сероконт-В и установление расчетных параметров для дальнейшего контроля качества (предпериод контроля). 2. Статистическая обработка полученных результатов. 3. Построение контрольных карт. 4. Оценка контрольных карт по предупредительным и контрольным критериям. Первый этап - это система накопления результатов исследований контрольной сыворотки на воспроизводимость. Так как в сыворотке концентрация вещества неизвестна и неисследована, то необходимо иметь запас сыворотки одной серии, чтобы хватило ее для работы на 1 год или хотя бы на 6 месяцев. Набор результатов контрольного материала на воспроизводимость проводится в течение 23-25 дней. Ежедневно или один раз в 2 дня растворяют сыворотку, если она сухая, и исследуют показатели, указанные в инструкции к определению тестов (глюкоза, холестерин, общий белок, мочевина и т.п.). Наряду с опытными пробами обрабатывают контрольную сыворотку в двух параллельных пробах, причем результаты измеряют на тех же приборах, что и опытные образцы. Растворенную сыворотку можно хранить 2 суток при температуре +4 град. C + 6 град. С или в замороженном состоянии 1 месяц. Из двух параллельных проб контрольной сыворотки вычисляют среднюю величину каждого параметра, записывают в виде столбика (см. табл. 4), и, таким образом, получают ряд чисел. Каждая величина одного дня обозначается статистическим знаком X. После набора материала переходят к следующему этапу - статистической обработке данных. Все результаты за 23-25 дней по отдельным видам исследований оценивают (сравнивают между собой). Если какая-либо величина (одна или больше) Х выходит далеко за пределы ряда показателей, то она отбрасывается и число дней исследований (n) уменьшается. Затем рассчитывают средний показатель (X), для чего все результаты суммируют: X1 + X2 + X3 + X4 + ... Xn = SUM X,
где X - средняя одного дня (из двух параллельных проб);
n - число дней исследования;
SUM X - сумма результатов всех дней исследований.
Среднюю величину вычисляют по формуле
_ SUM X
X = ------.
n
Затем определяется отклонение от средней величины результатов
каждого дня исследования без учета знака (плюс или минус), т.е.
вычисляют:
_ _ _
X - X1; X - X2; X - X3 и т.д.
_ 2
Все отклонения от средней величины суммируют SUM (Х - Х) и
находят среднее квадратическое отклонение (S) по формуле
_______________
_ 2
SUM (Х - Х) S
S = +- V -------------- V% = ----- х 100%
n - 1 _
Х
Таблица 4 ВНУТРИЛАБОРАТОРНЫЙ КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ РЕЗУЛЬТАТОВ-------------+---------------+---------------+----------------- ¦ ¦ ¦ _ ¦ _ 2 ¦ ¦ Дата ¦ Х ¦ Х-Х ¦ (Х-Х) ¦ +------------+---------------+---------------+---------------------+ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +------------+---------------+---------------+---------------------+ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +------------+---------------+---------------+---------------------+ ¦Тест ¦ ¦ ¦ ¦ +------------+---------------+---------------+---------------------+ ¦Метод ¦ ¦ ¦ ¦ +------------+---------------+---------------+---------------------+ ¦Прибор ¦ ¦ ¦ ¦ ¦------------+---------------+---------------+---------------------- Среднее квадратическое (стандартное) отклонение показывает разброс результатов от средней величины в одну (+) и другую (-) сторону. Пределом минимального разброса результатов (предел достоверности) допускают +-2S от средней величины. _ _ _ _
(Х + 1S; Х + 2S; Х - 1S; Х -2S).
Таблица 5 ПРИМЕР ИССЛЕДОВАНИЯ УРОВНЯ ХЛОРИДОВ НА ВОСПРОИЗВОДИМОСТЬ РЕЗУЛЬТАТОВ--------+----------------+-----------+------------+--------------
¦ N ¦ ¦ ¦ _ ¦ _ 2 ¦
¦ п/п ¦ Дата ¦ X ¦ Х-Х ¦ (Х-Х) ¦
¦ ¦ ¦ ммоль/л ¦ ммоль/л ¦ ммоль/л ¦
+-------+----------------+-----------+------------+------------------+
¦ 1. ¦ 2.01.94 ¦ 98 ¦ -2 ¦ 4 ¦
+-------+----------------+-----------+------------+------------------+
¦ 2. ¦ 3.01.94 ¦ 102 ¦ +2 ¦ 4 ¦
+-------+----------------+-----------+------------+------------------+
¦ 3. ¦ 4.01.94 ¦ 100 ¦ 0 ¦ 0 ¦
+-------+----------------+-----------+------------+------------------+
¦ 5. ¦ 5.01.94 ¦ 101 ¦ +1 ¦ 1 ¦
+-------+----------------+-----------+------------+------------------+
¦ 6. ¦ 8.01.94 ¦ 105 ¦ +5 ¦ 25 ¦
+-------+----------------+-----------+------------+------------------+
¦ 7. ¦ 9.01.94 ¦ 101 ¦ +1 ¦ 1 ¦
+-------+----------------+-----------+------------+------------------+
¦ 8. ¦ 10.01.94 ¦ 99 ¦ -1 ¦ 1 ¦
+-------+----------------+-----------+------------+------------------+
¦ 9. ¦ 11.01.94 ¦ 97 ¦ 3 ¦ 9 ¦
+-------+----------------+-----------+------------+------------------+
¦10. ¦ 12.01.94 ¦ 100 ¦ 0 ¦ 0 ¦
+-------+----------------+-----------+------------+------------------+
¦11. ¦ 14.01.94 ¦ 93 ¦ - ¦ - ¦
+-------+----------------+-----------+------------+------------------+
¦12. ¦ 15.01.94 ¦ 103 ¦ +3 ¦ 9 ¦
+-------+----------------+-----------+------------+------------------+
¦13. ¦ 16.01.94 ¦ 107 ¦ - ¦ - ¦
+-------+----------------+-----------+------------+------------------+
¦14. ¦ 17.01.94 ¦ 99 ¦ -1 ¦ 1 ¦
+-------+----------------+-----------+------------+------------------+
¦15. ¦ 18.01.94 ¦ 102 ¦ +2 ¦ 4 ¦
+-------+----------------+-----------+------------+------------------+
¦16. ¦ 19.01.94 ¦ 100 ¦ 0 ¦ - ¦
+-------+----------------+-----------+------------+------------------+
¦17. ¦ 21.01.94 ¦ 98 ¦ -2 ¦ 4 ¦
+-------+----------------+-----------+------------+------------------+
¦18. ¦ 22.01.94 ¦ 104 ¦ +4 ¦ 16 ¦
+-------+----------------+-----------+------------+------------------+
¦19. ¦ 23.01.94 ¦ 92 ¦ - ¦ - ¦
+-------+----------------+-----------+------------+------------------+
¦20. ¦ 24.01.94 ¦ 101 ¦ +1 ¦ 1 ¦
+-------+----------------+-----------+------------+------------------+
¦21. ¦ 25.01.94 ¦ 96 ¦ -4 ¦ 16 ¦
+-------+----------------+-----------+------------+------------------+
¦22. ¦ 26.01.94 ¦ 99 ¦ -1 ¦ 1 ¦
+-------+----------------+-----------+------------+------------------+
¦23. ¦ 28.01.94 ¦ 100 ¦ 0 ¦ 0 ¦
¦-------+----------------+-----------+------------+-------------------
_ _ 2
n = 20 SUM (Х - Х) = 2000 SUM (Х - Х) = 122
n = 20, т.к. величины отброшены из-за большого разброса (14, 16,
23.01.94).
_ 2000
Среднее арифметическое Х = ----- = 100 ммоль/л. Сумма
20
_ 2
квадратов отклонений от среднего SUM (Х - Х) = 122. Среднее
______
122
квадратическое отклонение S = +- V ----- = 2,53 ммоль/л. Коэффициент
19
2,53
вариации V% = ----- х 100% = 2,53%.
100
После вычисления S определяют критерий надежности Т, с помощью
которого оценивают максимальную и минимальную величину ряда чисел,
набранных в предпериоде.
_ _
Xмакс - X X - Xмин
Tмакс = ----------- Tмин = ----------.
S S
При n = 20 критерий надежности должен быть равен или быть меньше величины 2,62, при n = 10 Т должен быть равен или быть меньше величины 2,29. Величины ряда предпериода можно также оценить с помощью +-2S от средней арифметической. Если результат за какой-либо день не укладывается в эти пределы, то такой показатель за день выбрасывают и статистическую обработку проводят заново, т.е. рассчитывают новое стандартное отклонение S и так до тех пор, пока величины ряда не будут входить в пределы +-2S. Так, в данном примере на хлориды от Х+-2S отклоняются результаты 107,93 и 92 ммоль/л. Эти величины были отброшены до проведения статистической обработки, иначе после проведенной обработки данных вновь необходимо было бы находить отклонения от средней и вычислять S. Если оценим выброшенные величины с помощью Т, то они также выпадут. 107 - 100 100 - 92
Tмакс = --------- = 2,8 Tмин = -------- = 3,2,
2,5 2,5
т.е. показатели выходят за пределы 2,62.
После этого приступают к вычислению коэффициента вариации (V). В
2,53
примере на хлориды V = ------ х 100% = 2,53%.
100
Для большинства биохимических исследований V не должны превышать 4 - 5% для исследования активности ферментов 7 - 10%. Допустимые пределы аналитической вариации (V%) для ряда анализируемых компонентов, принятые рабочей группой экспертов по лабораторной диагностике стран, бывших членами СЭВ, приведены в табл. 6. Таблица 6 Допустимые пределы аналитической вариации (разброса) для анализируемых компонентов----+---------------------+-----T----+-------------------+----- ¦ N ¦ Анализируемый ¦ V% ¦ N ¦ Анализируемый ¦ V% ¦ ¦п/п¦ компонент ¦ ¦п/п ¦ компонент ¦ ¦ +---+---------------------+-----+----+-------------------+---------+ ¦1. ¦Адреналин ¦ 7 ¦21. ¦Лейцинаминопепти- ¦ 10 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦даза ¦ ¦ +---+---------------------+-----+----+-------------------+---------+ ¦2. ¦Аланинаминотранс- ¦ 7 ¦22. ¦Липиды общие ¦ 5 ¦ ¦ ¦фераза ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +---+---------------------+-----+----+-------------------+---------+ ¦3. ¦Альбумин ¦ 3 ¦23. ¦Магний ¦ 2 ¦ +---+---------------------+-----+----+-------------------+---------+ ¦4. ¦альфа-Амилаза ¦10 ¦24. ¦Медь ¦ 5 ¦ +---+---------------------+-----+----+-------------------+---------+ ¦5. ¦Аммиак ¦ 5 ¦25. ¦Мочевая кислота ¦ 7 ¦ +---+---------------------+-----+----+-------------------+---------+ ¦6. ¦Аспартатаминотрансфе-¦ 7 ¦26. ¦Мочевина ¦ 7 ¦ ¦ ¦раза ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +---+---------------------+-----+----+-------------------+---------+ ¦7. ¦Белок общий ¦ 3 ¦27. ¦Натрий ¦ 2 ¦ +---+---------------------+-----+----+-------------------+---------+ ¦8. ¦Белковые фракции ¦ 8 ¦28. ¦Норадреналин ¦ 7 ¦ +---+---------------------+-----+----+-------------------+---------+ ¦9. ¦Билирубин ¦10 ¦29. ¦Триацилглицерины ¦ 7 ¦ +---+---------------------+-----+----+-------------------+---------+ ¦10.¦Глюкоза ¦ 5 ¦30. ¦Фосфор ¦ 5 ¦ +---+---------------------+-----+----+-------------------+---------+ ¦11.¦Глюкоза-6-фосфат- ¦ 8 ¦31. ¦Фосфотазы щелочная ¦ 7 ¦ ¦ ¦дегидрогеназа ¦ ¦ ¦и кислая ¦ ¦ +---+---------------------+-----+----+-------------------+---------+ ¦12.¦ г -Глутамилтранс- ¦10 ¦32. ¦Хлор ¦ 3 ¦ ¦ ¦пептидаза ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +---+---------------------+-----+----+-------------------+---------+ ¦ ------------------------------- ¦ ¦ г - греческая буква "гамма". ¦ +---+---------------------+-----T----+-------------------+---------+ ¦13.¦Железо ¦ 5 ¦33. ¦Холинестераза ¦ 7 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦14.¦Иммуноглобулины ¦ 7 ¦34. ¦Холестерин ¦ 7 ¦ +---+---------------------+-----+----+-------------------+---------+ ¦15.¦Калий ¦ 2 ¦ ГЕМАТОЛОГИЯ ¦ +---+---------------------+-----+----+-------------------+---------+ ¦16.¦Кальций ¦ 2 ¦1. ¦Гемоглобин ¦ 2 ¦ +---+---------------------+-----+----+-------------------+---------+ ¦17.¦Кортизол ¦ 7 ¦1. ¦Гемоглобин ¦ 2 ¦ +---+---------------------+-----+----+-------------------+---------+ ¦18.¦Креатинин ¦ 5 ¦2. ¦Гематокрит ¦ 3 ¦ +---+---------------------+-----+----+-------------------+---------+ ¦19.¦Креатинкиназа ¦ 7 ¦3. ¦Лейкоциты ¦ 5 ¦ +---+---------------------+-----+----+-------------------+---------+ ¦20.¦Лактатдегидроге- ¦ 7 ¦4. ¦Эритроциты ¦ 5 ¦ ¦ ¦наза ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦---+---------------------+-----+----+-------------------+---------- Коэффициент вариации (V) используется для оценки результатов исследований, выполненных одним или разными методами, сравнения методов исследования, разных измерительных приборов, оценки результатов, выполненных в разных лабораториях. Допустимый предел ошибок (ДПО)Допустимый диапазон аналитического рассеивания (критерий Тонкса) зависит от пределов физиологических колебаний компонентов. Требования к точности исследований должны быть едины для всех лабораторий и для объективной оценки качества аналитических результатов необходим определенный критерий. Очевидно, что в хорошо работающей лаборатории величина среднеквадратического отклонения всегда будет ниже, чем в плохо работающей лаборатории. Если имеется большой разброс результатов, несмотря на то, что ежедневные _
контрольные значения лежат в пределах допустимой области (Х+-2S),
то может быть допущена ошибка. ДПО для каждого исследуемого
компонента можно рассчитать по формуле:
верхний предел нижний предел
1 х (нормальной области - нормальной области)
ДПО% = --------------------------------------------- х 100%
8 х среднюю норму
Если область нормальных значений узко ограничена, то соответствующие определения и методы должны иметь высокую точность, т.е. допустимая область имеет узкие границы. Если же область нормы относительно широка, то и точность определений может быть несколько меньшей. Пример расчета ДПО на хлориды: 1 х (110 - 95) 1 х 15 х 100
ДПО = -------------- х 100% = ----------- = 1,82%
8 х 102,5 820
При использовании в качестве ориентира 1/4 части диапазона физиологических колебаний допустимая аналитическая ошибка может увеличиться на 40% и более, следовательно, необходимо стремиться к более жестким допустимым пределам ошибки. Для большинства лабораторий более реально рассчитывать ДПО исходя из 1/8 диапазона физиологической нормы. Вычисления среднеквадратического отклонения (S) можно проводить экспресс-статистикой по Р.П.Бирюковой (1962). Х максимальная - Х минимальная
величина ряда величина ряда
S = +- ---------------------------------,
К
где К - коэффициент корреляции, найденный по табл.7 в зависимости
от n.
Так, при исследовании хлоридов Хмакс = 105 ммоль/л,
Хмин = 95 ммоль/л; n = 20; К по таблице = 3,73.
105 - 95 10
S = +- -------- = ----- = 2,6 ммоль/л.
3,73 3,73
Таблица 7 Коэффициент корреляции-------+-------+-------+------+------+------+------+------+------+------T--
¦ N ¦ 0 ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9 ¦
¦ п/п ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦
+------+-------+-------+------+------+------+------+------+------+------+------+
¦0 ¦ - ¦ - ¦1,13 ¦1,69 ¦2,06 ¦2,33 ¦2,53 ¦2,70 ¦2,85 ¦2,97 ¦
+------+-------+-------+------+------+------+------+------+------+------+------+
¦10 ¦3,08 ¦3,17 ¦3,26 ¦3,34 ¦3,41 ¦3,46 ¦3,53 ¦3,59 ¦3,64 ¦3,69 ¦
+------+-------+-------+------+------+------+------+------+------+------+------+
¦20 ¦3,73 ¦3,78 ¦3,82 ¦3,86 ¦3,90 ¦3,93 ¦3,96 ¦4,00 ¦4,03 ¦4,06 ¦
+------+-------+-------+------+------+------+------+------+------+------+------+
¦30 ¦4,09 ¦4,11 ¦4,14 ¦4,16 ¦4,19 ¦4,21 ¦4,24 ¦4,26 ¦4,28 ¦4,30 ¦
+------+-------+-------+------+------+------+------+------+------+------+------+
¦40 ¦4,32 ¦4,34 ¦4,36 ¦4,38 ¦4,40 ¦4,42 ¦4,43 ¦4,45 ¦4,47 ¦4,48 ¦
+------+-------+-------+------+------+------+------+------+------+------+------+
¦50 ¦4,50 ¦4,51 ¦4,53 ¦4,54 ¦4,56 ¦4,57 ¦4,59 ¦4,60 ¦4,61 ¦4,63 ¦
+------+-------+-------+------+------+------+------+------+------+------+------+
¦60 ¦4,64 ¦4,65 ¦4,66 ¦4,68 ¦4,69 ¦4,70 ¦4,71 ¦4,72 ¦4,73 ¦4,74 ¦
+------+-------+-------+------+------+------+------+------+------+------+------+
¦70 ¦4,75 ¦4,77 ¦4,78 ¦4,79 ¦4,80 ¦4,82 ¦4,82 ¦4,83 ¦4,83 ¦4,84 ¦
+------+-------+-------+------+------+------+------+------+------+------+------+
¦80 ¦4,85 ¦4,86 ¦4,87 ¦4,88 ¦4,89 ¦4,90 ¦4,91 ¦4,91 ¦4,92 ¦4,93 ¦
+------+-------+-------+------+------+------+------+------+------+------+------+
¦90 ¦4,94 ¦4,95 ¦4,96 ¦4,96 ¦4,97 ¦4,98 ¦4,99 ¦4,99 ¦5,00 ¦5,01 ¦
+------+-------+-------+------+------+------+------+------+------+------+------+
¦n ¦100 ¦200 ¦300 ¦400 ¦500 ¦600 ¦700 ¦800 ¦900 ¦1000 ¦
¦------+-------+-------+------+------+------+------+------+------+------+-------
----+-----T-----+-----T-----+-----T-----+-----T-----+-----T--
¦К ¦5,02 ¦5,49 ¦5,76 ¦5,94 ¦6,07 ¦6,18 ¦6,28 ¦6,35 ¦6,42 ¦6,48 ¦
¦---+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-----+-------
Таким образом, полученные результаты контроля по каждому
компоненту (глюкоза, мочевина, холестерин, общий белок и т.д.)
подвергают статистическому анализу. При получении
удовлетворительного V и сравнении его с ДПО переходят к следующему
этапу:
3-й этап - построение контрольной карты. Для этих целей на
_
миллиметровой (или другой) бумаге откладывают полученные значения Х
и отклонения от средней в пределах +-2S. На оси ординат отмечают
среднюю концентрацию компонента в соответствующих единицах
измерения. И вверх и вниз от средней параллельно ей проводят (в
соответствии с масштабом) прямые, которые обозначают +1S , +2S, +3S
и -1S, -2S, -3S. Контрольные карты готовятся для каждого
контролируемого теста, определяемого в лаборатории.
Таблица 8 Пример контрольной карты для хлоридовЧисла месяца----+------+---T---+---T---+---T---+---T---+---T---+---T---+---T---+---T---¬ ¦ ¦ммоль ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦----- ¦ 1 ¦ 2 ¦ 3 ¦ 4 ¦ 5 ¦ 6 ¦ 7 ¦ 8 ¦ 9 ¦10 ¦11 ¦12 ¦13 ¦14 ¦15 ¦16 ¦ ¦ ¦ л ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +---+------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+ ¦3S ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +---+------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+ ¦2S ¦105,0 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +---+------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+ ¦1S ¦102,5 ¦ . ¦ ¦ . ¦ . ¦ ¦ ¦ ¦ . ¦ . ¦ ¦ . ¦ . ¦ ¦ . ¦ . ¦ ¦ +---+------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+ ¦ _ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ Х ¦100,0 ¦ ¦ . ¦ ¦ ¦ . ¦ ¦ . ¦ ¦ ¦ . ¦ ¦ ¦ . ¦ ¦ ¦ ¦ +---+------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+ ¦-1S¦-97,5 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +---+------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+ ¦-2S¦-95,0 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +---+------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+ ¦-3S¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦---+------+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---+---- После этого продолжают исследовать контрольную сыворотку той же серии, с которой работали в предпериоде. Если это лиофилизированная сыворотка, то также ежедневно (или раз в 2 дня) вскрывается ампула и разводится сыворотка водой, как и раньше, согласно инструкции. Результаты исследования двух параллельных проб записывают в журнал, а среднее значение двух проб откладывают на карте в виде точки с указанием даты исследования. Для наглядности точки соединяют между собой линией (табл. 9). Различные варианты динамики результатов исследований пробы представлены на контрольных картах (1, 2, 3). Таблица 9 1 - пример хороших надежных результатов воспроизводимости, результаты распределяются с одинаковой частотой на каждой стороне от средней линии. *****НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ 2 - результаты не выходят за пределы допустимой области (+/-2S), однако, изо дня в день имеется большой разброс величин. Следует проанализировать все этапы исследования. *****НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ 3 - результаты также не выходят за пределы +/-2S, однако, явно появилась систематическая ошибка, для ее выявления необходимо провести контроль правильности, проверить реактивы, измерительные приборы, возможно, начал работать новый, плохо подготовленный лаборант. *****НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ 4-й этап. Оценка контрольных карт. Результаты последующих исследований контрольного материала (сыворотки типа Сероконт-В, той же серии, с которой работали в предпериоде) должны распределяться с одинаковой частотой на каждой стороне от линии средней арифметической и находиться в пределах +/-2S от средней. Контрольная карта дает в наглядной форме возможность своевременно выявить и предотвратить ошибки даже тогда, когда результаты анализа не выходят за границы +/-2S. Контрольную карту оценивают по предупредительным и контрольным критериям, ориентируясь на которые можно обнаружить ошибки в работе лаборатории. Предупредительные критерии 1. Шесть результатов подряд находятся по одну сторону от
_
средней линии (Х).
2. Три результата подряд расположились за пределами одного
среднеквадратического отклонения (+/-1S).
3. Один результат находится за пределами двух средних
квадратических отклонений (+/-2S).
4. Шесть результатов подряд имеют тенденцию наклона результатов
_
в одну сторону от средней (X).
При наличии предупредительных критериев следует проверить качество калибровочных или стандартных растворов, качество реактивов и сроки их приготовления, работу измерительных приборов. Возможно, появились субъективные погрешности (другой лаборант проводит исследования). Появление предупредительных критериев свидетельствует, что анализ может выйти из-под контроля, необходимо провести поиск причин, устранить их и провести контроль правильности. Контрольные критерии1. Восемь результатов подряд находятся по одну сторону от средней арифметической величины. 2. Пять результатов подряд расположены за линией одного среднеквадатического отклонения (+/-1S). 3. Три результата выходят за рамки +/-2S. 4. Один результат располагается за пределами +/-3S. При наличии контрольных критериев результаты исследований ставятся под сомнение (анализ вышел из-под контроля) и до исправления недостатков результаты анализов не должны выдаваться в клинические отделения. В таких случаях необходимо проверить все этапы производства анализа (чистоту реактивов, качество стандарта, контрольную сыворотку, мытье посуды, работу приборов и т.п.). Необходимо срочно провести контроль правильности по контрольным сывороткам типа Сероконт-П. VII. КОНТРОЛЬ ПРАВИЛЬНОСТИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙИсследование контрольного материала с известным содержанием компонентов - наиболее простой способ оценки правильности. Он может быть использован для быстрой ориентировочной оценки правильности результатов. Обязательным условием, ограничивающим возможность этого способа, является использование только того метода исследования, который указан в аннотации к контрольному материалу. Кроме того, проводящий анализ контрольной сыворотки с известной концентрацией, может слишком внушительно придерживаться того, что работает с контрольным материалом, и более тщательно будет проводить исследование. Если есть возможность избежать этого, то контроль будет более объективным. Контроль правильности должен осуществляться по всем диапазонам прямолинейного хода калибровочного графика, то есть контролю подвергаются как нормальные, так и патологические результаты. Контроль правильности результатов анализа периодически осуществляется как самим лаборантом, так и сотрудником лаборатории, ответственным за контроль качества. Для проведения контроля правильности необходимо иметь контрольный материал с нормальными и патологическими концентрациями вещества в контрольной сыворотке. Концентрация веществ в контрольных сыворотках зарубежного производства устанавливается референтной лабораторией страны-производителя и проверяется или адаптируется к методу в Республиканском и региональных центрах клинической лабораторной диагностики. Если полученные в лаборатории результаты исследования контрольной сыворотки укладываются в пределы допустимых отклонений содержания вещества, указанного в инструкции к сыворотке, то правильность удовлетворительна. Оценка правильности результатов исследования возможна с использованием статистического критерия Лорда (L). Для этих целей определяют 10-20 параллельных проб контрольного материала, вычисляют среднюю арифметическую величину, а затем сравнивают со средней величиной, указанной для контрольного материала (m). Расчет осуществляется по формуле _
X - м
L = --------------,
Xмакс - Xмин
_
где X - средняя величина из 10 - 20 проб;
м - среднее значение контрольной сыворотки;
Xмакс - максимальное значение из 10 - 20 проб;
Xмин - минимальное значение этого же ряда.
Статистически установлено, что различие недостоверно при
L = 0,23 или меньше этой величины. Например, при исследовании
содержания глюкозы получены следующие результаты: Xмакс из 10
_
величин ряда = 5,85 ммоль/л; Xмин = 5,05 ммоль/л; X = 5,45 ммоль/л;
м = 5,65 ммоль/л.
-------------------------------
м - греческая буква "ми".
5,65 - 5,45 0,20
L = ----------- = ---- = 0,25.
5,85 - 5,05 0,80
Полученное значение больше 0,23, следовательно, различие достоверно, а результаты неправильные. Критерий Лорда можно использовать только тогда, когда воспроизводимость результатов в лаборатории удовлетворительная. Наличие неправильности результатов требует мер по их устранению. Меру своей систематической погрешности лаборатория может определить при участии в межлабораторном контроле качества путем сравнения с результатами других лабораторий, работающих тем же методом. Если в контрольной сыворотке указано только среднее значение, при необходимости найти отклонение от средней величины, можно рассчитать S, исходя из коэффициента вариации (). Для большинства биохимических исследований (как было указано выше) V должен находиться в пределах 3 - 5%. Правильность результатов исследований зависит от наличия систематических ошибок. Систематические ошибки могут быть обусловлены рядом причин: недостаточная степень чистоты стандарта, неправильно построенный калибровочный график, некачественные реактивы, неисправность измерительных приборов и т.д. Постоянная и пропорциональная погрешность составляют общую систематическую ошибку. Для оценки правильности результатов исследования можно
использовать достоверность различия результатов и наличие
статистической связи. Статистическая достоверность различий
определяется посредством критерия Стьюдента. Для этих целей
_
рассчитывают ошибку средней арифметической величины Sx и критерий t.
Х1 - Х2 _ S
t = ----------------; Sx = ------,
______________ ___
/ _ 2 _ 2 V n
V Sx1 + Sx2
где X1 и X2 - средние арифметические результаты сравниваемых
величин;
n - число наблюдений.
Например, Х1 - величина, полученная в лаборатории, а Х2 - величина в контрольной сыворотке. Различия считаются достоверными, если t будет равным 2,0 или больше 2,0. (Р - показатель достоверности различий при этом будет равен 0,05 или меньше 0,05). Если Р больше 0,05, то различия на достигнутом уровне значимости не достоверны, следовательно, определяемая сравниваемая величина правильная. Таким образом, для статистической оценки правильности результатов при применении контрольных сывороток с известным содержанием компонентов наряду с тестом Лорда можно использовать и разностный метод критерия "t" Стьюдента. В литературе по статистическим методам можно найти и применять парный критерий Вилкоксона, рассчитывать коэффициент корреляции и регрессии. VIII. ПРОВЕДЕНИЕ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА БЕЗ КОНТРОЛЬНОГО МАТЕРИАЛАВнутрилабораторный контроль качества лабораторных исследований может осуществляться не только с помощью специальных контрольных материалов, но и методов, не требующих контрольных материалов. К ним относятся: исследование параллельных, случайных, исследование повторных проб и смешанных проб. Исследование параллельных проб позволяет оценить воспроизводимость результатов исследований с помощью образцов крови больных. Для этого выбранную пробу исследуют дважды. Результаты таких дублированных анализов используют для характеристики качества исследований. На принципе параллельных проб И.Георгиев (1985) рекомендует использовать контрольные R-карты. Принцип построения контрольных R-карт основан на использовании разницы двукратного определения исследуемого лабораторного показателя одного и того же исходного образца. По предварительно выбранному показателю пробу биологического материала произвольно выбранного больного исследуют дважды, первый раз - под N 1, а второй раз - под последним номером и определяют арифметическую разницу. Все это проделывают ежедневно в течение 15 дней (можно выбрать и другой срок), затем заполняют таблицу, подобную предложенной (см. табл. 10). Таблица 10 Примерные вычисления для получения R-карты содержания общего билирубина (мкмоль/л)-------+------+-----T-----+-------+----T------+------+----T------ ¦ N ¦ ¦ ¦ ¦ 2 ¦ N ¦ ¦ ¦ ¦ 2 ¦ ¦ п/п ¦ X' ¦ X" ¦ д X ¦ дX ¦п/п ¦ X' ¦ X" ¦ дX ¦ дX ¦ +------+------+-----+-----+-------+----+------+------+----+----------+ ¦ 1. ¦15,39 ¦16,76¦ 1,37¦ 1,8769¦ 9.¦ 15,39¦ 14,36¦1,03¦ 1,0609 ¦ +------+------+-----+-----+-------+----+------+------+----+----------+ ¦ 2. ¦23,08 ¦23,59¦ 0,59¦ 0,3481¦ 10.¦ 10,77¦ 10,77¦0 ¦ 0 ¦ +------+------+-----+-----+-------+----+------+------+----+----------+ ¦ 3. ¦10,26 ¦11,63¦ 1,37¦ 1,8769¦ 11.¦ 7,69¦ 8,04¦0,35¦ 0,1225 ¦ +------+------+-----+-----+-------+----+------+------+----+----------+ ¦ 4. ¦ 9,06 ¦ 9,41¦ 0,35¦ 0,1225¦ 12.¦ 30,78¦ 30,78¦0 ¦ 0 ¦ +------+------+-----+-----+-------+----+------+------+----+----------+ ¦ 5. ¦14,19 ¦15,39¦ 1,20¦ 1,4400¦ 13.¦ 11,63¦ 11,97¦0,34¦ 0,1156 ¦ +------+------+-----+-----+-------+----+------+------+----+----------+ ¦ 6. ¦10,26 ¦10,26¦ 0 ¦ 0 ¦ 14.¦ 7,69¦ 7,35¦0,34¦ 0,1156 ¦ +------+------+-----+-----+-------+----+------+------+----+----------+ ¦ 7. ¦ 9,06 ¦10,26¦ 1,20¦ 1,4400¦ 15.¦ 8,55¦ 8,55¦0 ¦ 0 ¦ +------+------+-----+-----+-------+----+------+------+----+----------+ ¦ 8. ¦15,39 ¦14,19¦ 1,20¦ 1,4400¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦------+------+-----+-----+-------+----+------+------+----+----------- ------------------------------- д - греческая буква "дельта". Расчет.
_________
/ 2 ______
/ SUM дX / 9,960 _____
R = V --------; R = V -----; = V 0,33 = 0,574.
2n 30
2
SUMдX = 9,96 2R = 1,148 2,5R = 1,435 3R = 1,722.
Примечания:
n - число наблюдений;
Х'- первое определение в серии;
X" - второе определение в серии;
2
дX - квадрат разницы;
2
SUMдX - сумма квадратов разниц.
Вычисляют границы допустимого предела (2R, 2,5R, 3R), на ось ординат контрольной карты наносят величины различий (дX) от 0 и обозначают уровень рангов: 2R, 2,5R, 3R. Определенный таким образом предел различий обозначает допустимые границы контроля воспроизводимости. Теоретически вычислено, что в 95% всех исследований разница между двумя параллельными пробами должна быть в интервале между 0 и 2,5R. На карту ежедневно наносят разницу между двумя параллельными пробами. В случаях, когда разница больше 3R ранга, серию исключают и повторно исследуют пробы. Для иллюстрации прилагается R-контрольная карта общего билирубина. Контрольная R-карта помогает констатировать, что результаты проб находятся в допустимых пределах либо вне их. Последнее свидетельствует о допущенной ошибке и необходимости повторных исследований. Однако по карте нельзя определить точные причины ошибок и проверить правильность результатов, а только воспроизводимость. Таблица 11 Контрольная карта для определения уровня общего билирубина Дни исследований *****НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ Исследование случайных пробЭтот метод аналогичен методу параллельных проб. Отличие заключается лишь в том, что лаборант выборочно исследует повторно одну или две пробы. Таким путем можно оценить воспроизводимость результатов исследования. Исследование повторных пробДля этого несколько случайно выбранных проб исследуется повторно. Сравнение соответствующих пар результатов дает объективные данные о качестве проведенных исследований. При проведении этого метода 5% образцов должны исследоваться повторно. Метод дает возможность оценить качество работы лаборанта и аппаратуры. Исследование смешанных пробМетод смешанных проб состоит в следующем: из группы образцов случайно выбирают два (А и Б); из каждого образца берут равные объемы и смешивают (получают образец С). Исследуют все три образца. Данные первого и второго образцов складывают и делят пополам. Затем определяют различия между величиной, полученной в смешанной пробе и средней первого и второго образцов. Для построения контрольной карты по этому методу рекомендуют проводить исследования смешанных проб в течение 30-40 дней. Таблица 12 Определение воспроизводимости по смешанным пробам-------------------+------+------+-------+-----------+----------- ¦ Компонент ¦ А ¦ В ¦ С ¦ (А+В)/2 ¦ Различие ¦ +------------------+------+------+-------+-----------+---------------+ ¦Гемоглобин, г/л ¦ 125 ¦ 142 ¦ 130 ¦ 133,5 ¦ 3,5 ¦ +------------------+------+------+-------+-----------+---------------+ ¦Гематокрит, л/л ¦ 0,47 ¦ 0,52 ¦ 0,50 ¦ 0,495 ¦ 0,5 ¦ ¦------------------+------+------+-------+-----------+---------------- Метод контроля по результатам проб пациентовЭто метод текущего контроля, который не требует специального контрольного материала и помогает обнаружить ошибки, являясь действительным контролем на весь процесс анализа. В этом случае для построения контрольной карты необходимо осуществить следующие этапы: 1. Выписать нормальные результаты отдельного теста за день, отбросив все патологические результаты. 2. Если количество результатов превышает 50, то использовать только первые 50, если более 200, то использовать только первые и последние 25 нормальных результатов. 3. Рассчитать среднее значение за день. 4. Продолжать также на протяжении месяца. _
5. Рассчитать среднее значение за месяц (X) и соответствующее
среднее квадратичное отклонение (S).
6. Построить контрольную карту со значениями +-2S. 7. Ежедневно откладывать результат средней нормальных величин на контрольной карте. Величины, укладывающиеся вне контрольного диапазона, указывают, соответственно, на завышение или занижение результата в день выполнения исследования. IX. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙДля контроля правильности определения гемоглобина используют стандартный раствор гемоглобина или контрольный материал с нормальным, повышенным и сниженным содержанием гемоглобина, контроля воспроизводимости - консервированную или стабилизированную кровь (гемолизат). Фиксированные клетки крови человека или животных применяют для контроля качества подсчета клеток крови, контрольные мазки (окрашенные и неокрашенные с нормальной лейкоцитарной формулой и с патологией) - используют при проведении контроля качества счета лейкоцитарной формулы. Контроль содержания гемоглобина. Стандартный раствор и контрольные растворы гемоглобина 3-4 уровней применяются для контроля правильности и построения калибровочной кривой. Для контроля воспроизводимости определения гемоглобина применяют растворы гемолизированной крови. Чтобы приготовить гемолизат берут консервированную или свежую нитратную человеческую кровь. Свежую кровь в количестве 100 мл (можно меньше) собирают в сосуд с 0,6 моль/л раствором лимоннокислого натрия из расчета 5:1. Цитратную кровь центрифугируют при 3000 об/мин 10-15 мин. Плазму сливают. К осадку эритроцитов добавляют 50 мл стерильной дистиллированной воды, тщательно перемешивают на магнитной мешалке (или вручную) в течение 30 мин. Гемолизат помещают на 24 часа в холодильник при -20 град. С. После этого раствор размораживают и вновь перемешивают. Раствор гемолизата фильтруют в стерильных условиях и разливают в стерильные ампулы и баночки по 1 мл. Хранят в холодильнике при -20 град. С. Раствор стабилен в течение года. Для оценки воспроизводимости определений гемоглобина гемолизат
исследуют в течение 20 дней, из полученных данных рассчитывают
_
среднюю величину (X), среднеквадратическое отклонение (S),
контрольные пределы (+/-2S) и строят контрольную карту. Коэффициент
вариации не должен превышать 5%. При возможности установить точную
концентрацию гемоглобина в гемолизате его можно использовать для
контроля правильности. Определяя концентрацию гемоглобина в крови,
необходимо избегать следующих ошибок:
1. Неправильный забор крови (гемолиз, сгустки, неточность забора). 2. Использование неточных пипеток на 0,02 мл и на 5 мл. 3. Неполное заполнение пипетки кровью. 4. Неточное пипетирование раствора для определения гемоглобина. 5. Недостаточно чистая посуда (следы крови или детергента). 6. Неточно откалиброван прибор (неточная концентрация стандарта). 7. Грязные кюветы или мутность растворенной пробы. 8. Несвоевременность исследования. Контрольные материалы для подсчета числа эритроцитовКонтрольная кровь представляет собой взвесь стабилизированных клеток. Наиболее часто фирмы производят контрольную кровь с 8 гематологическими параметрами: число лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов, концентрация гемоглобина, величина гематокрита, средний объем эритроцитов, усредненное содержание гемоглобина в одном эритроците и в общем объеме эритроцитов. Контрольные образцы с 12 параметрами дополнительно включают средний объем тромбоцитов, процентное соотношение содержания лимфоцитов, моноцитов, гранулоцитов. 1. Консервированная кровь. Консервированную кровь сохраняют вне организма в течение длительного срока с поддержанием всех биологических и функциональных свойств. Консервированная кровь должна сохраняться без явлений деструкции эритроцитов. Для приготовления консервированной крови в качестве
стабилизаторов используются антикоагулянты, и на основе этих веществ
предложены следующие консервирующие растворы (рН растворов доводят
до требуемого значения 0,1 моль/л NaOH):
I. 1. Натрий лимоннокислый (цитрат натрия) - 2 г (ч, чда).
2. D(+) - Глюкоза - 3,0 г, безводная (ч, чда).
3. Левомицетин - 0,075 г (фарм).
4. Дистиллированная вода- до 100 мл.
рН раствора доводится до 4,5 - 5,1. Консервированная кровь
готовится путем добавления к крови консервирующего раствора в
отношении 4:1.
II. 1. Лимонная кислота - 1,0 г (чда, хч).
2. D(+) - Глюкоза- З г, безводная (чда).
3. Натрий фосфорнокислый трехзамещенный - 0,75 г (ч, чда).
4. Дистиллированная вода - до 100 мл.
рН раствора доводят до 5,7 (5,5-6,0). Консервированную кровь
готовят путем добавления к крови консервирующего раствора в
отношении 4:1.
III. 1. Глюкоза - 25 г, безводная (ч, чда).
2. Натрий лимоннокислый - 22 г (чда).
3. Лимонная кислота - 8 г (чда, хч).
4. Дистиллированная вода - до 1000 мл.
рН раствора доводится до 6,4. Консервированная кровь готовится
путем добавления к крови консервирующего раствора в отношении 3:1.
IV. 1. D(+) - Глюкоза - 2,0 г, безводная (ч, чда).
2. Натрий лимоннокислый - 300,0 г (ч, чда).
3. Натрий фосфорнокислый безводный однозамещенный - 0,15 г (ч,
чда).
4. Дистиллированная вода - до 1000 мл.
рН раствора доводится до 6,9. Консервированная кровь готовится
путем добавления к крови консервирующего раствора в отношении 2:1.
V. 1. D(+) - Глюкоза - 20,5 г, безводная (ч, чда).
2. Натрий лимоннокислый - 8,0 г (ч, чда).
3. Лимонная кислота - 0,55 г (чда, хч).
4. Натрий хлористый - 4,2 г (ч, чда, хч).
5. Дистиллированная вода - до 1000 мл.
рН раствора доводится до 6,1. Консервированная кровь готовится
путем добавления к крови консервирующего раствора в отношении 4:1.
В консервированных растворах эритроциты сохраняют свои функциональные и биологические свойства в течение нескольких дней при Т 20-22 град. С, а в условиях холодильника - до 20-30 дней. Контроль качества определения эритроцитов с помощью контрольных материалов осуществляется следующим образом: в течение 20 дней проводят 2 определения количества эритроцитов в консервированной крови, рассчитывают среднюю величину, пределы колебаний и строят контрольную карту (см. табл. 13). Таблица 13 Пример расчета и построения контрольной карты для контроля качества подсчета эритроцитов в крови*****НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ Неудовлетворительная воспроизводимость результатов может быть обусловлена ошибкой в подсчете количества клеток в крови, неравномерным распределением клеток в камере. Контроль качества подсчета лейкоцитарной формулы в мазках кровиНеобходимой предпосылкой для правильного учета морфологических особенностей клеток крови является удачно сделанный и хорошо окрашенный мазок крови. Невыполнение одного из этих условий ведет к неправильному распределению клеток крови или плохому выявлению их морфологических особенностей, а вместе с тем и к ошибкам в определении. Хорошо сделанный мазок крови должен отвечать следующим условиям: 1. Мазок должен начинаться на 1 - 1,5 см от узкого края предметного стекла и кончаться в 2 - 3 см от его другого края. Общая длина мазка должна охватывать 0,5 - 0,75 площади стекла. 2. Мазок должен быть равномерной толщины, а не волнообразным. Хороший мазок крови толще всего вначале, постепенно утончается и заканчивается в виде следа как бы оставленного тонкой щеткой. 3. Мазок должен быть "свободным с края". Другими словами, слой крови не должен достигать длинного края стекла, а между ним и краем должно оставаться расстояние в несколько миллиметров. Мазки, превышающие 3/4 общей длины предметного стекла, очень толсты. Эритроциты в большей части такого препарата прижаты один к другому или ложатся монетными столбиками. Это мешает правильно исследовать их морфологию. Мазки короче 1/2 предметного стекла очень тонки. Лейкоциты отделены друг от друга, сильно деформированы и неправильно распределяются. Отсутствие свободных от крови краев означает, что использованное при приготовлении мазка шлифовальное стекло касалось края предметного стекла. В таких случаях большие клетки перемещаются к краю мазка и это вызывает неправильное распределение клеток. В неравномерном (волнообразном) мазке распределение клеток крайне неудовлетворительно. Толстые участки содержат больше лимфоцитов, тонкие - больше моноцитов и сегментоядерных клеток. Для доброкачественного исследования морфологии клеток большое значение имеет правильная его фиксация и окраска. Источники ошибокПравильная фиксация мазка придает стойкость форменным элементам крови по отношению к содержащейся в красках воде, которая без фиксации мазка гемолизирует эритроциты и изменяет строение лейкоцитов. Фиксация мазка, вызывая коагуляцию белка, прикрепляет препарат к стеклу. В качестве фиксаторов предложены: метиловый спирт, этиловый спирт, смесь Никифорова, состоящая из равных частей этилового спирта и серного эфира. Лучшим фиксатором является метиловый спирт. Недостаточная фиксация мазка дает слабую окраску нейтрофильной зернистости лейкоцитов и ведет к некачественной окраске клеток. Качественная окраска мазка позволяет правильно дифференцировать клетки крови и их структуру при микроскопическом исследовании. При применении любой методики окрашивания мазка крови важно точно соблюдать методические правила приготовления растворов и временные промежутки в течение процесса окрашивания. При приготовлении растворов необходимо учитывать рН воды; она должна быть нейтральной. Партии красителя, существующие в продаже, имеют различную интенсивность окраски. Это обязывает опытным путем установить оптимальную концентрацию (разведение) и время окрашивания для каждого флакона красителя, которые устанавливаются путем окрашивания серии препаратов растворами с различной концентрацией красителя, меняя длительность его воздействия. Для контроля качества подсчета лейкоцитарной формулы в мазках
крови используют контрольные мазки. Их готовят из капиллярной крови
доноров и больных на предметных стеклах, выполняя требования к
правильному приготовлению мазков, фиксации и окрашиванию. Затем
контрольные мазки многократно просчитываются (не менее 20 раз) по
200 клеток (не менее 5 квалифицированных специалистов). Из
полученных данных статистически рассчитывают критерии определения
_
правильности подсчета мазка путем расчета Х и +-2S. Контрольные
образцы, нормальные и патологические, регулярно вводятся в поток
клинических образцов и с их помощью проверяют качество работы
каждого сотрудника лаборатории. Подсчет считается правильным, если
результаты подсчета клеток входят в рассчитанные контрольные границы
_
Х +-2S для каждого вида клеток крови.
Суспензия фиксированных эритроцитовФиксация эритроцитов приводит к физико-химическим изменениям в мембране эритроцитов, что предохраняет клетки от лизиса. В качестве фиксирующего материала предложены формальдегид, танин, глутаральдегид, ледяная уксусная кислота. Наибольшее распространение получила методика фиксации эритроцитов глутаральдегидом. После фиксации размер клеток изменяется в течение первых 3-4 дней, затем остается стабильным от нескольких месяцев до нескольких лет. Методика приготовленияКровь собирают в сосуд с антикоагулянтом ЭДТА (5 мг сухого ЭДТА на 1 мл крови). Затем плазму трижды промывают изоосмотическим фосфатным буфером. Для этого к собранной крови добавляют раствор буфера в 2 раза больше объема крови и полученную суспензию центрифугируют в течение 10 минут при 3000 об/мин. Промытые эритроциты фиксируют 0,25% раствором глутаральдегида в фосфатном буфере, который постепенно добавляют к эритроцитам в отношении 1:10 (кровь:фиксирующий раствор). Фиксация производится при комнатной температуре в течение часа. Фиксированные эритроциты трижды промывают дистиллированной водой и доводят до окончательного объема водой или 12,5% раствором глицина. Затем добавляют 3 мл 1% раствора азида натрия. Тщательно перемешивают на магнитной мешалке в течение 30 минут и разливают в стерильные стеклянные пузырьки по 2-5 мл. Хранение проводят при Т 4 град. С. Перед использованием материал перемешивают на магнитной мешалке в течение 10 минут. Срок хранения - от 6 месяцев до 1 года. Суспензию используют для контроля качества подсчета эритроцитов автоматическим и камерным методами. Приготовление изоосмотического фосфатного буфера154 ммоль/л, рН7,4: 0,246 г однозамещенного фосфорнокислого калия и 3,187 г двузамещенного фосфорнокислого калия трехводного растворяют дистиллированной водой в мерной колбе на 100 мл. Ограничения применения консервированной крови и фиксированных клеток крови1. Дефицитность крови. 2. Фиксированные эритроциты обладают большей вязкостью по сравнению с кровью (прилипают к стенкам и не переходят в состояние суспензии). 3. Фиксирование клеток изменяет их электрический заряд, что влияет на правильность результатов при автоматическом подсчете клеток. 4. Фиксированные клетки более ригидны, что затрудняет их прохождение через отверстия анализатора и меняет амплитуду пульсовой волны (при автоматическом подсчете). 5. В первые 3-5 дней происходит уменьшение объема фиксированных эритроцитов, затем их размеры остаются стабильными в течение 6 месяцев. 6. Дефицитность реактивов (глутаральдегида и азида натрия). Возможные ошибки при подсчете количества клеток крови1. При взятии крови: а) неправильный забор крови (выдавливание из пальца, сгустки, гемолиз); б) использование неточно откалиброванных пипеток; в) неточное пипетирование и разведение крови; г) недостаточно быстрый забор крови и размешивание ее с реактивом для разведения. 2. При разведении: а) неточное пипетирование реактива для разведения; б) использование грязной посуды и пипеток; в) использование неточно откалиброванных пипеток; г) использование некачественного реактива для разведения, вызывающего гемолиз эритроцитов. 3. При измерении: а) несоблюдение правил подготовки счетной камеры; б) несоблюдение временных промежутков при подсчете количества эритроцитов в камере, необходимых для оседания клеток на сетку; в) нетщательное перемешивание крови перед заполнением камеры; г) подсчет клеток в недостаточном количестве квадратов и несоблюдение правил подсчета; д) использование неоткалиброванного прибора при автоматическом подсчете клеток. Метод сохранения мазков для многократного микроскопированияК 0,5 мл клея БФ-6 прибавляют 3 мл абсолютного спирта, 3 мл бутилового спирта и тщательно перемешивают до получения прозрачной жидкости с желтоватым оттенком. Хранят в склянке с хорошо притертой пробкой. На предметное стекло с мазком наносят пипеткой большую каплю пленкообразующей смеси и, покачивая стекло, дают ей равномерно растечься по его поверхности. Избыток смеси с края стекла удаляют и препарат кладут на горизонтальную поверхность для высушивания. При комнатной температуре пленка высыхает 15-20 минут. Для ускорения сушки мазок можно поместить в термостат при 60 град. С. X. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА ИССЛЕДОВАНИЙ МОЧИПочки выделяют ценный материал для исследования - мочу, микроскопический и химический анализ которой многое может рассказать о состоянии организма. Исследование мочи принадлежит к числу анализов, к которым чаше всего прибегает практический врач. Это понятно, ибо правильная диагностическая оценка данных исследования мочи помогает разобраться не только в почечной патологии, где правильный диагноз часто совершенно невозможен без анализа мочи, но также ориентирует его при ряде других заболеваний. Отсюда понятно, что анализ мочи должен быть произведен у каждого больного. Степень точности получаемых результатов исследований мочи, в основном, зависит от квалификации лаборанта, используемого оборудования, реактивов и методов исследования. Для получения правильных и воспроизводимых результатов исследования мочи используют контрольные материалы, близкие по возможности к образцам мочи пациентов, и контрольные мазки для контроля качества микроскопических исследований осадка мочи. Концентрация исследуемых веществ в контрольном материале должна соответствовать практической чувствительности используемого метода исследования. Контрольные материалы с высокими концентрациями веществ могут давать положительные реакции даже с испорченными реактивами или полосками с экспресс-тестами, а одной из важных задач контроля исследования мочи как раз и является выявление даже незначительной потери в чувствительности исследуемого метода (особенно при качественных пробах). В качестве контрольных материалов для контроля химического состава мочи используют: 1. Водные растворы веществ. 2. Сливную мочу с консервантами. 3. Искусственные растворы мочи с добавками веществ, исследуемых в моче. Способы приготовления контрольных материаловКонтрольные препараты для микроскопии осадков мочи должны содержать встречающиеся в моче соли, полиморфные эпителиальные клетки, различные виды цилиндров, лейкоциты, эритроциты, болезнетворные и неболезнетворные бактерии, грибы, паразиты животных. Кроме того, целесообразно иметь препараты с осадками мочи, характерными для наиболее распространенных заболеваний. Кроме использования контрольных материалов применяют метод параллельных проб, смешанных и повторных проб (см. выше). Водные растворы веществ с известным содержанием используются для контроля качества исследований (определения или обнаружения) химического состава мочи (например, раствор глюкозы, мочевины, альбумина). Приготовление слитой мочиСлитая моча используется в качестве контрольного материала для контроля качества исследований химического состава мочи. 1.1. Реактивы. 1. Слитая человеческая моча, 1 л. 2. ЭДТА, хч, 2,0 г. 3. Изопропиловый спирт, хч, 1 л. 4. Раствор тимола, 5 мл (100 г тимола растворяют в 1 л изопропилового спирта). Используются обычно применяемые в лаборатории методы для качественного и количественного исследования химического состава мочи. 1.2. Способ приготовления. К 1 л свежей человеческой мочи добавляют 2 г этилендиаминтетраацетата натрия (ЭДТА) и при энергичном встряхивании и перемешивании флакона приливают 5 мл раствора тимола. Через 2 недели мочу центрифугируют для удаления слизи и незначительного количества мочевой кислоты. После такой обработки моча становится прозрачной и почти не имеет запаха. Контрольный материал хранят при комнатной температуре. Срок годности - несколько лет. 1.3. Приготовление контрольных растворов, имитирующих мочу. Контрольный раствор N 1. Применяется в качестве контрольного материала для контроля качества исследований химического состава мочи. 1. Натрий хлористый ч, чда, хч. 2. D(+) - Глюкоза, безводная, ч, чда. 3. Мочевина ч, чда. 4. Ацетон ч, чда. 5. Цельная кровь с величиной гематокрита 0,40-0,45 л/л. 6. Белок сыворотки крови. Используют сыворотку пациента с исследованным содержанием общего белка или контрольную сыворотку. 7. Хлороформ высокой степени очистки. Используют методы качественного исследования химического состава мочи. Способ приготовленияВ круглодонную колбу вместимостью 2 л вносят 10 г хлористого натрия, 10 г мочевины, 1 г глюкозы и 4 мл ацетона (табл.14). Таблица 14 Перечень добавляемых веществ и их концентрация в конечном растворе---------------------+-----------------+------------------------- ¦ ¦ Добавляемое ¦ Концентрация вещества в ¦ ¦ Вещество ¦ количество ¦ контрольном растворе ¦ ¦ ¦ вещества ¦ ¦ +--------------------+-----------------+-----------------------------+ ¦NaCl ¦ 10,0 г ¦ - ¦ +--------------------+-----------------+-----------------------------+ ¦Мочевина ¦ 10,0 г ¦ 83 ммоль/л ¦ +--------------------+-----------------+-----------------------------+ ¦Глюкоза ¦ 1,0 г ¦ 2,775 ммоль/л ¦ +--------------------+-----------------+-----------------------------+ ¦Белок ¦ 0,8 г ¦ 0,4 г/л ¦ +--------------------+-----------------+-----------------------------+ ¦Гемоглобин (скрытая ¦ 0,2 мл ¦ полож. ¦ ¦кровь) ¦ ¦ ¦ +--------------------+-----------------+-----------------------------+ ¦Ацетон ¦ 4,0 мл ¦ полож. ¦ ¦--------------------+-----------------+------------------------------ Приливают 500 мл воды и перемешивают до полного растворения солей. Микропипеткой вносят 0,2 мл цельной крови, 0,8 г белка сыворотки крови. Для расчета необходимого количества сыворотки используют формулу: 1000 х 0,8
Объем = --------------------
сыворотки содержание белка
мл в используемой сыворотке
Например, если используемая сыворотка содержит 75 г/л общего белка, то объем сыворотки, содержащей 0,8 г белка, будет равен: (1000 х 0,8)/75 = 10,7 мл. Затем доводят объем дистиллированной водой до 2 л и хорошо перемешивают. Для консервации в полученный раствор добавляют 5 мл хлороформа. Раствор хранят при комнатной температуре в посуде с притертой пробкой. Срок годности - около года. Контрольный раствор N 2. Применяется в качестве контрольного материала для контроля качества исследований химического состава и микроскопического исследования осадка мочи. Реактивы. 1. Калий фосфорнокислый однозамещенный (КН2РО4), хч, 0,37 ммоль/л. 2. Натрий фосфорнокислый двузамещенный (Na2НР04 х 7Н20), чда, 0,19 моль/л. 3. Сыворотка крови с нормальным содержанием белка. 4. D(+) - Глюкоза, безводная, ч, чда. 5. Ацетон, ч, чда. 6. Гемолизат. К эритроцитарной массе добавляют равный объем дистиллированной воды и тщательно перемешивают. 7. Фиксированные эритроциты. 8. Фиксированные лейкоциты светлого слоя кровяного сгустка. 9. Фиксированные непатогенные Е.coli. 10. Фиксированные клетки дрожжей. 11. Фиксированные сперматозоиды. 12. Кристаллы цистина. Получают путем перекристаллизации из химически чистого порошка L-цистина. 13. Кристаллы триппельфосфатов. Получают из осадков проб мочи больных. 14. Кристаллы оксалата кальция. Получают из осадков проб мочи больных. 15. Натрий хлористый, ч, чда, хч, 145 ммоль/л. 16. Формалин, фарм. Используют методы исследования химического, микроскопического состава мочи. Способ приготовленияВ мерную колбу на 100 мл вносят 12,2 мл КН2Р04, 116 мл. Na2НР04х7Н20, 5 мл сыворотки с нормальным содержанием белка, 1,0 г глюкозы, 0,5 мл ацетона, 0,1 мл гемолизата и доливают дистиллированной водой до метки. Перемешивают до полного растворения и замораживают. Для получения осадка в контрольный раствор добавляют соответствующие компоненты, которые предварительно фиксируют. Метод фиксацииКаждый компонент, добавляемый для образования осадка, промывают в холодном физиологическом растворе и смешивают с раствором водного формалина с физиологическим раствором (10,0 мл формалина + 0,85г% NaCl 100,0 мл). Фиксацию проводят в течение 12 часов. В контрольный раствор добавляют от 1,0 до 5,0 мл фиксированного материала. Контрольный раствор хранят при -20 град. С. Срок хранения - до 3 месяцев. Контрольный материал N 3. Используется для контроля качества диагностических полосок. Реактивы. 1. Глюкоза (для инъекций в/в). 2. Ацетон, ч, чда. 3. Слитая человеческая сыворотка. 4. Цельная кровь. К 0,1 мл цельной крови добавляют 0,1 мл дистиллированной воды для лизиса эритроцитов. 5. Соляная кислота 0,1 моль/л. 6. Натрий хлористый, ч, чда, 152 ммоль/л. Используются диагностические полоски и качественные пробы. Способ приготовленияВ мерную колбу на 500 мл с 200 мл дистиллированной воды добавляют 5 мл глюкозы, 2 мл ацетона, 25 мл слитой человеческой сыворотки и 0,1 мл лизированной крови. Тщательно перемешивают и доводят объем до метки физиологическим раствором. Используя 0,1 моль/л HCl, величину рН доводят до величины 6,0. Контрольный раствор хранят в холодильнике. Срок годности - более одного месяца. Приготовление сливной мочи для токсикологических исследованийПрименяется в качестве контрольного материала для контроля качества токсикологических исследований в моче. Реактивы. 1. Сливная моча. Отбирают пробы мочи пациентов (не курящих и не принимающих лекарств) и собирают слив объемом до 10 л. Для исключения посторонних примесей сливную мочу фильтруют через стеклянную вату. Хранят при +4 град. С +7 град. С. 2. Морфин гидрохлорид, фарм. 3. Кодеин сульфат, фарм. 4. Хинин гидрохлорид, фарм. 5. Метадон гидрохлорид, фарм. 6. Фенобарбитал натрия, фарм.7. 7. Глютетимид, фарм. 8. Амфетамин, фарм. 9. Абсолютный спирт. Используются обычно применяемые в лаборатории методы исследования токсикологических веществ в моче. Способ приготовленияЧасть собранной сливной мочи исследуют на содержание наиболее часто употребляемых лекарств. Сливную мочу используют только в случае отрицательной реакции. Затем к моче добавляют по 20,0 мг морфина гидрохлорида, кодеина сульфата, хинина гидрохлорида, метадона гидрохлорида, фенобарбитала натрия и глютетимида, а также 30,0 мг амфетамина. Перед добавлением в слив глютетимид нужно растворить в 3 мл абсолютного спирта. Хорошо перемешать и разлить по 10-15 мл в пузырьки. Сливную мочу хранят при -20 град. С. Срок годности - около 8 месяцев. Для использования в качестве контрольного материала сливную мочу оттаивают и исследуют вместе с пробами больных. Источники ошибок при исследовании мочиОпределение относительной плотности мочи урометром: 1. Сосуд, содержащий мочу, должен быть достаточного размера, чтобы урометр свободно плавал в нем. В противном случае результат будет неправильным. 2. Пока идет считывание результатов, урометр не должен прикасаться к стенкам или дну сосуда. Если мочи не достаточно для свободного перемещения урометра, ее разводят дистиллированной водой в 2-3 раза, определяют относительную плотность и умножают на степень разведения. 3. Для определения относительной плотности большое значение имеет температура окружающей среды и исследуемой пробы, так как урометры приспособлены для измерения при определенной температуре (15 град. С, 20 град. С, 22,5 град. С), обозначенной на приборе. Любое отклонение температуры окружающей среды от обозначенной приводит к изменению объема мочи, а также ее концентрации и относительной плотности. Это обстоятельство нужно иметь в виду и в случае надобности вносить соответствующую коррекцию на температуру. Точность этого метода для клинических целей достаточна, если только пользоваться проверенными урометрами. Определение относительной плотности на рефрактометре1. Так как показатель преломления измеряется оптически, то призма и камера должны быть совершенно чистыми и без царапин. После каждого исследования обе части промывают дистиллированной водой и протирают досуха мягкой неворсистой тканью. Нельзя использовать газ для сушки. Для предохранения от пыли прибор нужно держать под чехлом. 2. Измерить показатель преломления 5+/-0,01% раствора хлористого натрия. Показатель должен быть равен 1,3415+/-0,0005 или по шкале относительной плотности - 1,022+/-0,001. Исследуя содержание белка в моче методами, основанными на осаждении белков, необходимо соблюдать правила, нарушение которых приводит к значительным ошибкам при определении. 1. Исследуемая моча должна иметь кислую реакцию. При щелочной реакции мочу слегка подкисляют уксусной кислотой, т.к. щелочная моча может привести к нейтрализации кислоты и к отрицательному результату при положительной реакции. 2. Моча должна быть прозрачной. Мутность необходимо предварительно удалить каким-нибудь способом, не вызывая осаждения белка. При исследовании пробы с мутной мочой нет возможности ясно разграничить ранее имевшуюся мутность от получившейся при осаждении белков. Исследование скрытой кровиПодобный гемоглобину эффект дают хлорофилл, миоглобин, препараты железа и другие случайные примеси, в особенности соли тяжелых металлов (хрома, меди и т.д.). Поэтому необходимо при работе употреблять абсолютно чистую посуду и реактивы. Ложноположительная проба получается после приема солей йодистого и бромистого калия. Наличие этих солей в моче можно узнать по синей окраске, появляющейся при смешивании мочи с уксусной кислотой, перекисью водорода и с раствором крахмала. В моче, содержащей много лейкоцитов, можно получить ложно-положительную реакцию, поэтому такую пробу исследуют после предварительного нагревания мочи для инактивации ферментов гнойных клеток. Моча, которую исследуют на кровь, должна быть свежей. При стоянии гемоглобин превращается в метгемоглобин, который не имеет псевдоперексидазного действия и дает отрицательные пробы. Влияние консервантов на результаты исследования мочиПеред использованием какого-либо консерванта следует иметь в виду следующие их особенности: хлороформ осаждается на дно пробирки и мешает исследованию осадка, кроме того он может восстанавливать медь и, тем самым, искажать результат определения глюкозы. Тимол в количестве 0,1 г на 100 мл мочи не обладает такими отрицательными качествами и, вместе с тем, сохраняет мочу на несколько дней, но прибавленный в большом количестве, он может помешать кольцевой реакции на белок и реакции на индикан. Прибавление борной кислоты отражается на определении глюкозы. Формальдегид в количестве 2-3 капель очень удобен как консервант для изучения осадка, но в большом количестве сам дает осадок, и кроме того, мешает определению белка, глюкозы и индикана. Карболовая кислота затрудняет определение ацетона. Толуол - самое удобное средство для сохранения мочи прибавляют в таком количестве, чтобы на всей поверхности плавал тонкий его слой. Могут быть другие варианты рецептов приготовления контрольной мочи и использование других стабилизаторов. XI. МЕЖЛАБОРАТОРНЫЙ (ВНЕШНИЙ) КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙМежлабораторный (внешний) контроль качества лабораторных исследований - это контроль сравнимости результатов, полученных в нескольких лабораториях на одном и том же контрольном материале одними и теми же методами или методами, дающими статистически достоверно совпадающие результаты. Осуществление межлабораторного контроля качества дает возможность решать следующие задачи: 1) сравнить качество работы всех участвующих в контроле лабораторий; 2) выявить систематические, случайные и грубые погрешности в результатах контрольных определений; 3) оценить качество используемых методов исследования, аппаратуры, реактивов и т.д.; 4) каждая лаборатория может сравнить качество своей работы с результатами других лабораторий, участвовавших в контроле, а также удостовериться в эффективности осуществления внутрилабораторного контроля качества исследований. Основная цель межлабораторного контроля качества лабораторных исследований - выявить и устранить ошибки и достичь сравнимых результатов в лабораториях. В зависимости от длительности проведения контроля различают краткосрочный и долгосрочный контроль. Межлабораторный контроль качества лабораторных исследований осуществляется периодически не реже 1 раза в квартал организационно-методическим и контрольным центром по лабораторному делу республики, области. При осуществлении межлабораторного контроля качества исследований контрольный центр проводит следующие организационные мероприятия: 1) определение даты и срока проведения контроля; 2) выбор, оповещение и регистрацию участвующих лабораторий (кодирование); 3) составление и размножение протокола контрольных определений и контрольной программы (инструкции) для участника межлабораторного контроля качества; 4) определение срока подачи результатов контрольных исследований; 5) рассылку контрольных образцов; 6) сбор результатов контрольных определений; 7) статистическую обработку полученных данных; 8) оценку качества работы участвующих лабораторий (общая и индивидуальная), рекомендации для устранения источников ошибок. Дата и сроки проведения определяются количеством участвующих лабораторий, их территориальным размещением, видом контроля (кратким или долгосрочным), наличием контрольного материала. Все клинико-диагностические лаборатории, независимо от их производительности и штата, должны в обязательном порядке участвовать в межлабораторном контроле качества. В межлабораторном контроле качества лабораторных исследований должно принимать участие не менее 20 лабораторий. Только при этом условии можно гарантировать получение достаточной информации и надежной оценки качества выполнения лабораторных исследований. Чтобы в контроле могло принимать участие возможно большее число лабораторий, количество контролируемых компонентов на начальном этапе не должно быть слишком большим. Целесообразно начинать контроль с нескольких компонентов (например, глюкоза, мочевина, общий белок, креатинин и холестерин). В последующем число компонентов необходимо расширить. Протокол контрольных измерений представляет собой таблицу с перечнем контролируемых компонентов. В протокол заносятся полученные результаты контрольных исследований, используемые методы исследования, реактивы (наборы реактивов), а также дополнительная информация, интересующая контрольный центр. Протокол высылается каждому участнику в двух экземплярах. Примерные образцы протоколов приведены в конце методических указаний. Контрольная программа. Исследование контрольных проб проводят по программе, составленной контрольным центром. В программе должны быть указаны все основные этапы работы: 1) условия хранения и растворения контрольного материала; 2) перечень контрольных исследований; 3) перечень закодированных методов исследования; 4) дата и срок проведения контрольных исследований и срок представления полученных результатов; 5) точный адрес контрольного центра; 6) дополнительная информация (по усмотрению контрольного центра). Оценка результатовДля оценки результатов межлабораторного контроля качества проводится следующая статистическая обработка материала: 1. Оценка статистического распределения результатов участников по каждой контрольной пробе отдельно. Если имеют место многопиковые статистические распределения частоты, то надо выявить факторы влияния (например, разные методы исследования) и в зависимости от этого распределить все результаты на гомогенные группы. 2. В случае симметричного распределения (например, при
_
нормальном распределении) рассчитывают среднюю арифметическую (X) и
среднеквадратическое отклонение (S). Для исключения грубых ошибок
применяют метод "исключения" (за критерий берут границу в +/-2S).
Если результаты исследования какой-либо лаборатории не укладываются
в пределы +-2S от средней величины лаборатории, то показатели
лаборатории считаются неудовлетворительными и отбрасываются. Число
исключенных величин регистрируют.
3. При отсутствии нормального распределения вычисляют медиану и процентили 5 и 95. Оценка правильности результатовОценка результатов контроля правильности в своей основе подобна оценке сравнимости. Главное различие заключается в установленном критерии оценки. При контроле правильности - это номинальная величина, которая устанавливается на основе результатов, полученных в референтных лабораториях. При контроле сравнимости - это скоррегированная средняя величина результатов всех участников. Основой для оценки результатов определения отдельного параметра при обоих видах контроля служит разница между полученной и установленной величиной (критерием). Всю информацию о номинальных величинах и подробный анализ полученных результатов необходимо высылать каждому участнику не позже месяца после получения ответов. Это дает возможность участникам как можно скорее устранить допущенные ошибки. Разницу между полученной и установленной величиной наиболее просто можно представить в виде относительной величины в процентах. Сравнительная оценка нескольких лабораторий, которые исследовали один и тот же параметр, может быть изображена таким образом, что отдельные лаборатории располагаются по возрастающим процентным отклонениям. Для оценки сравнимости (или правильности) результатов отдельных лабораторий используют также индекс среднеквадратического отклонения (15). Для этого результат каждой лаборатории выражают в относительных единицах среднеквадратического отклонения по формуле Хлаб. - М
IS = ---------,
S
где Хлаб. - результат лаборатории, которую оценивают; М и S - паспортные данные контрольной сыворотки (истинное значение и среднеквадратическое отклонение). Полученный результат считается приемлемым в том случае, если величина IS не превышает 2,0 балла. Одновременно результаты можно представить в графической форме, если в контроле использовали 2 образца контрольного материала с разной концентрацией компонентов. Наиболее простой является форма модифицированного графика Youden, в котором однозначно обозначаются результаты лабораторий. Равнонаправленные отклонения обоих результатов свидетельствуют о наличии систематических ошибок. _
Скоррегированные величины средней арифметической (X) и
среднеквадратического отклонения (S) служат для оценки общей сравнимости отдельных лабораторий. Для оценки межлабораторной воспроизводимости результатов участвующих лабораторий полученную величину коэффициента вариации по каждому компоненту сравнивают с величиной допустимого предела ошибок, рассчитанной по формуле Тонкса. При долгосрочном контроле с многократными определениями одной контрольной пробы рассчитывают среднюю арифметическую величину и среднеквадратическое отклонение (n = 10). Отклонение средней величины от должной величины проверяют на значимость (тест "t"). Статистически значимое отклонение сравнивают с допустимым отклонением, устанавливаемым в зависимости от компонентов и концентраций. При несовпадении - результаты неправильны. Среднеквадратическое отклонение проверяют на статистически значимое совпадение с требуемой воспроизводимостью, устанавливаемой в зависимости от компонентов и концентраций. При статистически значимом совпадении воспроизводимость результатов участника контроля не отвечает поставленным требованиям. Результаты статистической обработки представляются в виде таблицы по каждому разделу лабораторной диагностики, которая должна содержать данные о сравнимости результатов и о их качестве. Каждый контрольный материал должен иметь подробную характеристику (завод-изготовитель, номер серии). Для всех контролируемых параметров должны даваться номинальные величины, средние величины, среднеквадратические отклонения и коэффициенты вариации до и после коррекции, а также количества лабораторий, которые определили данный параметр. Лабораториям необходимо сообщать процент отклонения их результатов для отдельных компонентов или величину индекса среднеквадратического отклонения. Кроме таблиц следует дать общую оценку качества выполнения всех участников контроля и индивидуальную оценку каждой лаборатории с соответствующими рекомендациями по выявлению и устранению причин ошибочных результатов. Независимо от сообщений, которые высылаются всем лабораториям после каждого проведенного контрольного опыта, целесообразно периодически готовить более обширный анализ результатов, охватывающий несколько контрольных опытов. Цель такого резюме - дать характеристику тенденции качества лабораторных результатов всех контролируемых лабораторий за рассматриваемый период времени и информировать лаборатории о сопоставимости их результатов с результатами всех лабораторий. При проведении межлабораторного контроля качества лабораторных исследований необходимо соблюдать анонимность участников контроля. Все лаборатории шифруются под определенным кодом так, что каждая лаборатория знает только свой код. По запросу о результатах контрольного эксперимента информируются руководители отделов здравоохранения на местах, а также при отсутствии эффективности контроля, когда какая-нибудь из участвующих лабораторий систематически показывает ошибочные результаты и соответствующая помощь со стороны контрольного центра не дает желаемого результата. Построение графика YoudenКроме статистической обработки результаты межлабораторного контроля можно представить в графическом изображении, которое позволяет лабораториям сравнить свои результаты с результатами референтной лаборатории и дифференцировать тип допущенной ошибки. Для использования графика каждая лаборатория должна определить данный компонент в двух контрольных образцах с разной концентрацией (например, А и В). Для построения графика строится система координат на оси абсцисс откладывают номинальные значения компонента и интервалы среднеквадратического отклонения для пробы А, а на оси ординат - те же показатели для пробы В (рис.1). Масштаб для среднеквадратического отклонения берется одинаковый для обеих проб (А и В). Из точек Х и Y, соответствующих номинальным значениям данного компонента А и В, проводят две взаимно перпендикулярные прямые. Из точки пересечения этих прямых проводят окружность радиусом, равным +-2S. Затем, под углом 45 градусов к оси абсцисс проводят прямые: прямую - через центр окружности и две прямые и касательные к окружности. Пары значений для А и В, полученные от каждой лаборатории, наносятся в виде точки на график. Если точки попали внутрь окружности, результаты пригодны. Если точки попали вне окружности, но между касательными прямыми - это значит, что в лаборатории получили завышенные или заниженные величины для обеих проб, и указывает на систематические ошибки. Точки, расположенные близко к центральной прямой, показывают, что лаборатория работает стабильно. Точки, попавшие в другие секции графика, не дают представления о правильности результата и свойственны случайным ошибкам. Таким образом, график Youden позволяет наглядно дифференцировать систематические и случайные ошибки, допущенные в работе лаборатории, а также лаборатории, работающие в допустимых пределах. Каждая участвующая лаборатория получает бланк оценки своих результатов и результатов всех участников со статистической обработкой и, кроме того, график Youden на каждый контрольный компонент. На графике выделяют точку, соответствующую результатам данной лаборатории по одному из компонентов. На рисунке представлен график Youden для результатов исследования холестерина (метод Илька) в двух контрольных сыворотках с исследованным содержанием холестерина. Исследования проводили 62 лаборатории, участвовавшие в межлабораторном эксперименте. Результаты 46 лабораторий оказались хорошими, так как точки попали в окружность. Все остальные результаты ошибочны. Выделенная точка с кодовым номером 52 в правом верхнем квадранте означает, что при исследовании в данной лаборатории была допущена систематическая ошибка, так как результаты обеих проб оказались завышенными. Если взять точку с кодовым номером 15 в левом верхнем квадранте, то можно сказать, что при этом исследовании была допущена случайная ошибка, так как один результат оказался близким к номинальному значению (в пробе В), а в другой - занижены (в пробе А). Таким образом, каждая лаборатория имеет возможность по графику оценить не только качество своих исследований данного компонента в контрольном материале, но и определить вид допущенной ошибки. Рис.1График Youden*****НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ XII. ОБРАЗЦЫ ПРОТОКОЛОВ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Протокол биохимических определений
Адрес учреждения ____________________ Код _____________________
Тип учреждения ______________________
Зав. лабораторией ___________________
Ответственный за контроль ___________
Дата проведения контроля ____________ Подпись
-----+----------------+---------+----------------+---------------
¦ N ¦ ¦ ¦ Прибор, ¦ Результаты ¦
¦п/п ¦ Показатели ¦ Метод ¦ реактивы ¦ исследования и ¦
¦ ¦ ¦ ¦(указать фирму) ¦ единицы измерения ¦
+----+----------------+---------+----------------+-------------------+
¦1. ¦Общий белок ¦ ¦ ¦ ¦
+----+----------------+---------+----------------+-------------------+
¦2. ¦Холестерин ¦ ¦ ¦ ¦
+----+----------------+---------+----------------+-------------------+
¦3. ¦Глюкоза ¦ ¦ ¦ ¦
+----+----------------+---------+----------------+-------------------+
¦4. ¦Мочевина ¦ ¦ ¦ ¦
+----+----------------+---------+----------------+-------------------+
¦5. ¦Креатинин ¦ ¦ ¦ ¦
+----+----------------+---------+----------------+-------------------+
¦6. ¦Хлориды ¦ ¦ ¦ ¦
+----+----------------+---------+----------------+-------------------+
¦7. ¦Натрий ¦ ¦ ¦ ¦
+----+----------------+---------+----------------+-------------------+
¦8. ¦Калий ¦ ¦ ¦ ¦
+----+----------------+---------+----------------+-------------------+
¦9. ¦Общий билирубин ¦ ¦ ¦ ¦
+----+----------------+---------+----------------+-------------------+
¦10. ¦Аланинамино- ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦трансфераза ¦ ¦ ¦ ¦
+----+----------------+---------+----------------+-------------------+
¦11. ¦Аспартатамино- ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦трансфераза ¦ ¦ ¦ ¦
+----+----------------+---------+----------------+-------------------+
¦12. ¦а-Амилаза ¦ ¦ ¦ ¦
+----+----------------+---------+----------------+-------------------+
¦13. ¦Щелочная ¦ ¦ ¦ ¦
¦ ¦фосфатаза ¦ ¦ ¦ ¦
¦----+----------------+---------+----------------+--------------------
2. Протокол гематологических исследований
Адрес учреждения ____________________ Код _____________________
Тип учреждения ______________________
Зав. лабораторией ___________________
Ответственный за контроль ___________
Код _________________________________
Дата проведения контроля ____________ Подпись
Лейкоцитарная формула
---------------------------+----------+------------+-------------
¦ Мазки крови ¦ N 1 ¦ N 2 ¦ N 3 ¦
+--------------------------+----------+------------+-----------------+
¦Методика окраски ¦ ¦ ¦ ¦
+--------------------------+----------+------------+-----------------+
¦Клетки ¦ ¦ ¦ ¦
+--------------------------+----------+------------+-----------------+
¦Базофилы ¦ ¦ ¦ ¦
+--------------------------+----------+------------+-----------------+
¦Эозинофилы ¦ ¦ ¦ ¦
+--------------------------+----------+------------+-----------------+
¦Палочкоядерные нейтрофилы ¦ ¦ ¦ ¦
+--------------------------+----------+------------+-----------------+
¦Сердича сегменто-ядерные ¦ ¦ ¦ ¦
¦нейтрофилы ¦ ¦ ¦ ¦
+--------------------------+----------+------------+-----------------+
¦Лимфоциты ¦ ¦ ¦ ¦
+--------------------------+----------+------------+-----------------+
¦Моноциты ¦ ¦ ¦ ¦
¦--------------------------+----------+------------+------------------
Исследование консервированной крови
----------------------------+----------+-----------+-------------
¦ ¦ ¦ ¦ Результаты и ¦
¦ Показатели ¦ Метод ¦ Прибор ¦ единицы ¦
¦ ¦ ¦ ¦ измерения ¦
+---------------------------+----------+-----------+-----------------+
¦Эритроциты ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------------+----------+-----------+-----------------+
¦Гемоглобин ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------------+----------+-----------+-----------------+
¦Лейкоциты ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------------+----------+-----------+-----------------+
¦Тромбоциты ¦ ¦ ¦ ¦
+---------------------------+----------+-----------+-----------------+
¦Цветовой показатель ¦ ¦ ¦ ¦
¦---------------------------+----------+-----------+------------------
3. Протокол исследований химического состава мочи
Адрес учреждения ____________________ Код _____________________
Тип учреждения ______________________
Зав. лабораторией ___________________
Ответственный за контроль ___________
Дата исследования ___________________ Подпись
--------------------------+----------+----------+----------------
¦ Показатели ¦ Метод ¦ Прибор ¦ Результаты и ¦
¦ ¦ ¦ ¦ единицы измерения ¦
+-------------------------+----------+----------+--------------------+
¦Общий белок ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------------------+----------+----------+--------------------+
¦Глюкоза ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------------------+----------+----------+--------------------+
¦Скрытая кровь ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------------------+----------+----------+--------------------+
¦Ацетон ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------------------+----------+----------+--------------------+
¦Билирубин ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------------------+----------+----------+--------------------+
¦Мочевина ¦ ¦ ¦ ¦
+-------------------------+----------+----------+--------------------+
¦Реакция (рН) ¦ ¦ ¦ ¦
¦-------------------------+----------+----------+---------------------
XIII. ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ МАТЕРИАЛОВ1. Контрольные сыворотки и препараты для биохимических, гематологических и других видов исследований всех инофирм, разрешенные к применению на территории республики, в соответствии с используемым референтным методом установления контрольных значений: Lachema (Чехия), Labsystems (Финляндия), Abbott (США), Beckman (США), Cormay (Польша), Hoffmann la Roche (Швейцария), Bayer (Австрия), Boehringer Mannheim и Human (Германия). 2. Ставропольский НИИ вакцин и сывороток (Россия). Сероконт-В - контрольная лошадиная сыворотка для контроля воспроизводимости результатов исследований ручными и автоматическими методами. Сероконт П-эквин - контрольная лошадиная сыворотка с исследованным содержанием компонентов в нормальной концентрации для контроля правильности результатов исследований ручными и автоматизированными методами. Патосероконт-П-эквин - контрольная лошадиная сыворотка с исследованным содержанием компонентов в патологической концентрации для контроля правильности результатов исследований ручными и автоматическими методами. Сероконт-П контрольная человеческая сыворотка для контроля правильности результатов исследования липидных компонентов. Контрольная человеческая сыворотка с исследованным содержанием компонентов в нормальной концентрации для контроля правильности результатов исследования активности ферментов. Перечень контрольных материалов для исследования мочи1. Контрольные материалы с исследованным содержанием компонентов в нормальной концентрации для контроля правильности результатов исследований химического состава мочи. 2. Контрольные материалы с исследованным содержанием компонентов в патологической концентрации для контроля правильности результатов исследований химического состава мочи. Перечень контрольных материалов для коагулологических исследований1. Стандартный препарат тромбопластина с установленным временем. 2. Контрольная человеческая плазма с установленным временем частично активированного тромбопластина (АЧТВ). 3. Контрольная человеческая плазма с расширенными тестами коагулограммы. XIV. ПРОФ. КОНЕВАЛОВА Н.Ю. (РЕСПУБЛИКАНСКИЙ ЛИПИДНЫЙ ЛЕЧЕБНО-ДИАГНОСТИЧЕСКИЙ КОНСУЛЬТАТИВНЫЙ ЦЕНТР, г.ВИТЕБСК)10. Особенности проведения контроля качества при исследованиях липидного обменаМеждународные эпидемиологические и проспективные исследования, такие, например, как Фремингемское, показали, что частота ИБС в популяции закономерно возрастает с повышением уровня холестерина (ХС) в сыворотке крови. Классическим доказательством связи риска ИБС с уровнем ХС в сыворотке стали результаты 6-летнего многоцентрового наблюдения за 361662 мужчинами в возрасте от 35 до 57 лет. В этом исследовании было обнаружено, что смертность от ИБС является наименьшей среди мужчин с уровнем ХС 181 мг/дл (4,68 ммоль/л) или ниже. С повышением уровня ХС выше 181 мг/дл смертность от ИБС возрастала. Так, при уровне ХС от 182 до 202 мг/дл она увеличивалась в среднем в 1,3 раза, от 203 до 221 мг/дл - в 1,7 раза. У мужчин с уровнем ХС в сыворотке крови выше 245 мг/дл риск смерти от ИБС был в 3,4 раза больше, чем у мужчин с уровнем ХС 182 мг/дл или ниже. Говорить только о холестерине, характеризуя липидные нарушения, - это очень упрощенный подход к данной проблеме. Липидные нарушения имеют гораздо более сложный характер и оптимально для их характеристики определять три показателя. Это - общий холестерин, холестерин ЛПВП и триацилглицерины. Если эти три показателя определены, то дальше можно рассчитать и холестерин ЛПНП, ЛПОНП и различные коэффициенты, отражающие соотношения холестерина высокой плотности и холестерина низкой плотности. Но в практической деятельности очень часто обходятся определением общего холестерина и этого часто оказывается вполне достаточно. Это особенно важно для нашей страны, так как определение других реакций липидов возможно только в специализированных учреждениях. Что считать нормальным уровнем холестерина? Раньше, оценивая нормальный уровень холестерина, говорили о каких-то региональных уровнях, в настоящее время для всего мира характеристики нормального и повышенного уровня холестерина едины. Нормальный уровень холестерина - это 200 мг/дл или 5,2 ммоль/л и ниже. До 250 мг/дл или 6,5 ммоль/л - это легкая гиперхолестеринемия. От 250 до 300 мг/дл (или 7,3 ммоль/л) - это умеренная гиперхолестеринемия, высокая гиперхолестеринемия - ХС выше 100 мг/дл. 10.1. Взятие крови для исследования липидов плазмыСодержание липидов в плазме и соотношения липопротеинов являются вариабельными величинами, на которые влияют прием пищи, курение, потребление алкоголя, изменения диеты, поза больного и стресс. Важно, чтобы условия взятия образцов крови при первичном обследовании и при последующих анализах были стандартными. В некоторых случаях может оказаться необходимым повторение анализов, чтобы добиться получения наиболее воспроизводимых результатов. Следующие факторы являются важными. 1. Перед взятием крови пациент должен голодать в течение 14 - 16 ч. Больному не следует делать внутривенные вливания жидкостей, содержащих липиды. 2. Перед проведением исследования в течение 2 недель пациент должен находиться на обычной для него диете и масса его тела должна оставаться постоянной. 3. Если не проводится мониторинг лечения, больному не следует назначать какие-либо терапевтические мероприятия, направленные на понижение содержания липидов в плазме. 4. На определяемые величины концентрации липопротеинов влияют застой крови в венах и поза пациента. При взятии крови у больного в положении лежа концентрация холестерина в плазме может быть приблизительно на 10% ниже, чем при взятии крови у этого же больного в положении стоя. Зависимость определяемой концентрации триацилглицеринов от позы пациента может быть даже несколько большей. При оценке эффекта лечения путем серии повторных анализов важно стандартизовать процедуру взятия крови. Например, в течение 30 мин перед взятием крови больному следует сидеть. 5. Проведение исследований, направленных на выявление и характеристику типа гиперлипидемий, предпочитают отложить на 3 месяца после инфаркта миокарда, больших хирургических операций или любой тяжелой болезни, поскольку стресс может изменять содержание липидов в плазме. Однако исследования проб крови, взятой на протяжении первых 12 ч после инфаркта миокарда, по-видимому, отражают истинные величины содержания липидов в плазме. 6. Не следует гепаринизировать пробы крови; необходимо по возможности быстро отделить плазму или сыворотку от клеточных элементов крови. 10.2. Измерение концентрации общего холестерина кровиТочное измерение концентрации общего холестерина и холестерина, связанного с липопротеинами различной плотности, необходимо для правильного определения степени риска заболевания, а также контроля лечения. При применении соответствующей диеты содержание холестерина можно снизить на 10 - 15%, но использование метода, дающего ошибку 10 - 15%, не позволяет следить за такими изменениями. Поэтому в клинических лабораториях должна быть достигнута точность измерения, при которой коэффициент вариации должен быть не выше 3 - 5%. На уровень ХС оказывают влияние предшествующий прием пищи и алкоголя, интенсивные физические тренировки, фармакологические препараты, включая гормональные контрацептивы, стероиды, гиполипидемические препараты. Сезонные и дневные вариации не оказывают существенного влияния на уровень ХС в сыворотке крови. Для определения ХС можно использовать сыворотку или плазму крови. В качестве антикоагулянта для получения обычно используют "сухой" ЭДТА (1 мг на 1 мл крови), который обладает также антиоксидантными свойствами. Концентрация ХС в сыворотке крови на 2-4% ниже, чем в плазме крови. После центрифугирования сыворотку крови следует быстро отделить от кровяного сгустка для предотвращения динамического обмена свободного ХС между сывороткой и мембраной эритроцитов. Если определение не проводят в тот же день, то образцы сыворотки могут быть заморожены и сохранены при -20 град. С в течение нескольких месяцев, а при -80 град. С - в течение нескольких лет. После оттаивания сыворотку крови тщательно перемешивают. ХС достаточно стабилен в сыворотке крови, но денатурация белков в процессе микробного роста может изменить экстракцию ХС. Методы определения ХС в сыворотке крови многочисленны; можно выделить химические, ферментные и физико-химические. В свою очередь среди химических методов выделяют прямые и непрямые (экстракционные). Основой прямых методов определения ХС является реакция Либерманна-Бурхардта, в которой ХС взаимодействует со смесью серной, уксусной кислот и уксусного ангидрида. Реакция протекает в сильно кислой безводной среде. В результате окисления образуется окрашенное соединение, но развивающаяся окраска неустойчива, поэтому время фотометрирования следует точно выдерживать. В литературе можно встретить разное соотношение ингредиентов в реактиве Либерманна-Бурхардта; чем выше содержание уксусного ангидрида, тем с большей скоростью протекает реакция. Реакция ХС со смесью Либерманна-Бурхардта неспецифична. В реакции прямого определения ХС-реакционная смесь со стандартным раствором имеет изумрудный цвет; пробы сыворотки могут давать зеленый, голубой, бурый цвет. Это связано с тем, что, учитывая значительное эндогенное образование тепла, в реакцию вступают многие компоненты сыворотки крови. Кроме того, в реакции Либерманна-Бурхардта свободный ХС и его эфиры формируют цветные комплексы с разным коэффициентом молярного поглощения: в случае эфиров оптическая плотность оказывается более высокой. Это изначально вносит ошибку в исследование, поскольку неизвестно отношение свободный ХС: эфиры в каждой из проб. При определении ХС большое значение имеет выбор условий реакции с учетом того, что стабильность реактива Либерманна-Бурхардта ограничена. На определение ХС влияют многие факторы: соотношение реагентов в реакционной среде, количество воды, время и температура реакции; это требует стандартизации условий определения. Многие компоненты сыворотки крови реагируют с реактивом Либерманна-Бурхардта, давая сходную с ХС окраску. Билирубин дает наибольшую неспецифическую реакцию (1 мг билирубина эквивалентен 5-6 мг ХС); в реакции Киллиани-Зака интерференция билирубина является меньшей. Гемоглобин, мочевая кислота, витамин А и стероиды влияют на ход реакции. Все галогены, нитраты и нитриты, салицилаты, полиненасыщенные кислоты также дают интерференцию. По данным В.Н.Титова и др., неспецифическое завышение результатов при прямом определении ХС составляет 11%. Другим распространенным методом определения ХС является реакция Киллиани-Зака: реакция ХС с солями железа, уксусной и серной кислотами. Описано много модификаций способа: цитрат и фосфат добавляют для стабилизации окраски, имеющей максимум поглощения в зеленой области спектра, при этом максимум поглощения образовавшихся соединений меняется от 420 до 563 нм. В реакции Киллиани-Зака свободный ХС и его эфиры дают сходные по молярной экстинкции цветные комплексы. При непрямых методах липиды из сыворотки крови вначале экстрагируют органическими растворителями, а после упаривания выполняют реакцию Либерманна-Бурхардта. Такие методы более воспроизводимы и специфичны, поскольку удается убрать интерферирующие вещества, остающиеся в водной фазе. Для экстракции используют системы этанол - диэтиловый эфир, этанол - ацетон, метанол - хлороформ; наиболее часто применяют гексан, изопропиловый спирт. Включение этапа экстракции повышает специфичность метода; результаты определения ХС на 7% ниже, чем при прямом методе. Трехстадийные методы, помимо экстракции ХС органическими растворителями, включают этап гидролиза эфиров ХС гидроокисью калия или натрия. Экстракция липидов в неполярный растворитель, омыление эфиров ХС и повторная экстракция ХС из омыленной смеси составляют основу референтных методов. В качестве референтного метода наиболее предпочтительным является метод Абелла-Кендалла, предложенный в 1952 году. В методе Абелла-Кендалла эфиры ХС омыляют спиртовым раствором гидроокиси калия и экстрагируют петролейным эфиром (фракция 40 градусов - 60 градусов). Реакцию Либерманна-Бурхардта ставят после упаривания петролейного эфира. Трудности приготовления стандартных растворов ХС связаны с его гидрофобностью. Длительное время в качестве стандартного раствора применяли раствор ХС в ледяной уксусной кислоте. В таких условиях через определенное время весь ХС оказывался в форме ацетата ХС, что приводило к систематической ошибке (занижение результатов определения). Далее в качестве стандартного был предложен раствор ХС в изопропаноле. Однако изопропиловый спирт испаряется, является гигроскопичным; стандартные растворы приходилось хранить в холодильнике, эксикаторе и прогревать до комнатной температуры перед дозированием. К тому же такой "стандарт" оказался неудобным при ферментативных методах определения ХС, поскольку изопропанол неспецифически активировал ферментные системы, завышая оптическую плотность. Затем в качестве стандарта были предложены водные растворы ХС. Методы приготовления водного раствора ХС являются многоэтапными и довольно трудоемкими. На I этапе ХС растворяют в органическом растворителе (этанол, изопропанол, изобутанол). На II этапе смешивают раствор ХС с буфером, содержащим детергент, который способствует формированию мицеллярных структур. В результате включения ХС в мицеллы, образованные детергентом, происходит его солюбилизация. Можно приготовить раствор ХС и без применения органических растворителей и детергентов. Для солюбилизации ХС в концентрации 5 г/л Abell и соавт. использовали дезоксихолат натрия в концентрации 150 г/л в 0,15 М NaCl. Однако применение водных растворов ХС неудобно: их нельзя замораживать и длительно хранить в холодильнике. При комнатной температуре происходит старение растворов ХС с необратимыми изменениями, связанными с образованием комплексов микрокристаллов ХС. Для определения ХС при работе с биохимическими анализаторами общепринято использование калибраторов - сывороток крови, уровень ХС в которых определен референтными методами. Несмотря на относительную простоту исполнения и дешевизну процедуры, химические методы токсичны, применение их на современных анализаторах вызывает коррозию системы. 95% лабораторий мира используют ферментативный способ определения ХС. Преимуществами этого способа являются: проведение реакции в водной фазе; удобство автоматизации; высокая чувствительность и специфичность. В настоящее время, как правило, ферментативное определение XC проводится с помощью готовых наборов реактивов, выпускаемых рядом зарубежных фирм. Эти наборы содержат все необходимые для определения ХС-компонента в точно отмеренных количествах, что еще более упрощает и ускоряет процедуру анализа. Методические трудности энзиматического определения ХС связаны с гетерогенностью распределения ХС между ЛП, а также с активностью его эстерификации в крови. Свободный ХС располагается на поверхности мицеллярного комплекса, а эфиры ХС погружены внутрь ЛП-частицы. Поэтому, прежде чем эфиры ХС станут доступными для холестеролэстеразы, необходимо разрушить ЛП-частицы. Для солюбилизации ХС применяют детергент (тритон, твин, соли желчных кислот). Детергенты образуют мицеллоподобные структуры, в которые включен ХС. В таких условиях реакция происходит на разделе фаз, на поверхности мицеллярных комплексов. Однако солюбилизируя ХС, некоторые детергенты ингибируют активность холестеролэстеразы и холестеролоксидазы. Полнота гидролиза эфиров ХС зависит и от источника выделения фермента. Холестеролэстераза микробов более активно гидролизует эфиры ХС, образованные насыщенными жирными кислотами, тогда как панкреатическая - эфиры ХС, образованные полиненасыщенными жирными кислотами. Одним из следствий неполноты гидролиза ЭХС, по мнению многих иследователей, могут быть более низкие значения концентрации ХС в сыворотке крови, получаемые некоторыми ферментативными методами, по сравнению со значениями, определяемыми химическим методом Абеля-Кендала. Концентрация ХС в сыворотке, по данным ферментативных методов, может быть ниже, чем полученная методом Абеля-Кендала на 2,6 - 4,9% и даже на 20%. Кроме неполноты гидролиза ЭХС, причиной несколько заниженных по сравнению с химическим методом результатов ферментного анализа ХС может быть высокая специфичность последнего. Калибровку ферментных методов определения ХС проводят при помощи первичных или вторичных стандартов. Первичные стандарты представляют собой растворы ХС или его эфиров в органических растворителях или в водных растворах детергентов. В качестве вторичных стандартов используют сыворотки крови с известным содержанием ХС (калибровочные сыворотки). Калибровка с использованием вторичных стандартов является предпочтительной в сравнении с калибровкой по первичным стандартам. В ряде случаев ферментативный гидролиз ЭХС проходит не до конца вследствие низкой скорости гидролиза ЭХС некоторых жирных кислот. Возникающее при этом занижение результатов анализа может быть в значительней мере уменьшено при калибровке по сывороточным стандартам, имеющим состав эфиров, близкий к таковому в анализируемой пробе. Показано также, что скорость образования хромогена при анализе ХС сыворотки крови выше, чем при анализе первичного стандарта. Использование первичных стандартов ХС для калибровки анализа ХС в сыворотке может приводить к получению завышенных результатов по сравнению с калибровкой по вторичному стандарту (при фиксированном времени и условиях анализа), что следует принимать во внимание при выборе способа калибровки. Наличие детергентов, добавляемых в водные стандартные растворы ХС и его эфиров, а также присутствие спиртов, используемых для приготовления первичных стандартов, могут приводить к снижению ферментативной активности холестеролэстеразы и холестеролоксидазы. Использование в качестве калибратора некоторых коммерческих сывороток может приводить к завышению результатов вследствие высокого содержания в них эфиров уксусной и арахидоновой кислот, добавляемых для повышения концентрации ХС и гидролизуемых холестеролэстеразой с относительно низкой скоростью. Предполагается, кроме того, что холестеролэстераза может инактивироваться в присутствии компонентов коммерческой сыворотки. Применение в качестве калибратора нативной замороженной сыворотки с известным содержанием ХС, которая по составу ЭХС мало отличается от анализируемой, является лучшим способом достижения высокой степени правильности получаемых результатов. Несмотря на высокую специфичность, результаты, получаемые ферментными методами анализа зависят от влияния некоторых соединений, обычно присутствующих в сыворотке (гемоглобин, билирубин, мочевая кислота и др.) или введенных извне (лекарственные препараты). Однако мешающее влияние мочевой кислоты и гемоглобина наблюдается лишь в концентрациях, значительно превышающих физиологические - 20 и 100 мг/дл соответственно. При анализе сильно гемолизированной сыворотки методами, включающими фенол-4-аминоантипирин-пероксидазную систему, могут быть получены завышенные величины вследствие взаимодействия гемоглобина с хромогенной системой. Этот эффект может быть устранен путем вычитания оптического поглощения реакционной смеси, не содержащей холестеролоксидазы, из величины поглощения полной реакционной смеси. В отличие от гемоглобина присутствие билирубина в концентрациях, близких к физиологическим, приводит к занижению результатов на 1-6%. В большей степени влиянию билирубина подвержены ферментные методы, основанные на стехиометрическом определении перекиси водорода. Эффект билирубина имеет двойную природу: с одной стороны, билирубин взаимодействует с гидроперекисью, образовавшейся в процессе реакции холестеролоксидазы, конкурируя за нее с пероксидазой и уменьшая количества гидроперекиси, вступающей в реакцию с хромогенной системой. С другой стороны, взаимодействуя с перекисью водорода, билирубин разрушается, что приводит к уменьшению поглощения этим соединением в области 500 нм. Влияние билирубина можно в значительной степени уменьшить, создав условия преимущественного протекания реакции по пероксидазному пути посредством увеличения концентрации пероксидазы в реакционной среде. Степень интерференции билирубина прямо пропорциональна его концентрации и не зависит от содержания ХС. При анализе сывороток с известным содержанием билирубина расчет концентрации ХС может быть проведен с учетом соответствующей поправки. Для уменьшения до минимума влияния билирубина предлагают добавлять в реакционную смесь ферроцианид калия. Глюкоза и креатинин в концентрациях, в несколько раз превышающих физиологические, не оказывают заметного влияния на результаты анализа. Аскорбиновая кислота даже в физиологических концентрациях может занижать результаты анализа ХС ферментным методом на 1-8%. Присутствие в сыворотке этого соединения в терапевтических концентрациях (около 10 мг/дл) приводит к значительному (35% - 75%) занижению результатов. Липемия может обусловливать небольшое (до 3%) занижение результатов определения ХС-ферментным методом, причем степень этого занижения различна для разных методов. Разнообразие существующих в настоящее время способов ферментного анализа обусловливается различиями в способах определения продуктов его окисления, образующихся в результате холестериноксидазной реакции. Концентрация одного из продуктов этой реакции - холест-4-ен-З-она - может быть определена непосредственно по изменению поглощения реакционной смеси при 240 нм. Наибольшее распространение, однако, получили фотометрические методы, основанные на количественном определении другого продукта холестериноксидазной реакции - перекиси водорода. В табл. 1 представлена сводная информация о современных фотометрических ферментных методах анализа ХС в сыворотке и плазме крови, наиболее часто используемых в клинических лабораториях. Окрашенные продукты, образующиеся при взаимодействии перекиси с компонентами используемых при этом разных хромогенных систем, поглощают в видимой области спектра и стабильны в течение 60 - 90 мин, что в значительной степени упрощает фотометрирование и позволяет использовать наиболее распространенные в клинических лабораториях фотометры и автоанализаторы. Эти методы характеризуются хорошей воспроизводимостью, линейностью в широком диапазоне концентраций ХС. Таблица 1 Наиболее распространенные фотометрические ферментные методы количественного определения ХС в сыворотке крови----------+-----------+---------------------------+------------+-------+--- ¦ ¦ ¦ Условия анализа ¦Коэффициент ¦Коэффи-¦ ¦ ¦Употреб- ¦ Система ¦ ¦ вариации ¦циент ¦Линей- ¦ ¦ляемое ¦определения¦------+------+-----T-------+-----+------+корре- ¦ность ¦ ¦название ¦ перекиси ¦ ¦ ¦ ¦отноше-¦внут-¦меж- ¦ляции с¦метода,¦ ¦метода ¦ водорода ¦длина ¦время,¦тем- ¦ние ¦рисе-¦серий-¦методом¦ммоль/л¦ ¦ ¦ ¦волны,¦ мин ¦пера-¦объемов¦рий- ¦ный ¦Абеля- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦нм ¦ ¦тура ¦проба/ ¦ный ¦ % ¦Кендала¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦реагент¦ % ¦ ¦ ¦ ¦ +---------+-----------+------+------+-----+-------+-----+------+-------+-------+ ¦CHOD-РАР ¦4-ААД/фенол¦ 500 ¦ 10 ¦ 25 ¦ 1/100 ¦ 1,0-¦ 1,3- ¦ 0,987 ¦ До ¦ ¦ ¦пероксидаза¦ (546)¦ 5 ¦ 37 ¦ ¦ 3,0 ¦ 6,0 ¦ ¦ 18-25 ¦ +---------+-----------+------+------+-----+-------+-----+------+-------+-------+ ¦Метод ¦Метанол/ ¦ 405 ¦ 60-75¦ 37 ¦ 1/250 ¦ 2,0 ¦ 3,0 ¦ 0,996 ¦ До 25 ¦ ¦Кагеяма ¦каталаза ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Ацетилаце- ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦тон/аммиак ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +---------+-----------+------+------+-----+-------+-----+------+-------+-------+ ¦Метод ¦Иодид калия¦ 365 ¦ 30 ¦ 25 ¦ 1/200 ¦ - ¦ 3,0 ¦ 0,950 ¦ До ¦ ¦Хеккеля- ¦Молибден ¦ (405)¦ 20 ¦ 30 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ 12-15 ¦ ¦Перлика ¦аммония ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦Меркотест¦Этанол/ ¦ 340 ¦ 20 ¦ 21 ¦ 1/100 ¦ - ¦ 3,0- ¦ 0,950 ¦ До 11 ¦ ¦ ¦каталаза ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ 4,4 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦НАДР/АДГ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ +---------+-----------+------+------+-----+-------+-----+------+-------+-------+ ¦АБТС ¦АБТС/ ¦ 410 ¦ - ¦ 30 ¦ 1/250 ¦ 0,2-¦ - ¦ 0,990 ¦ До 13 ¦ ¦[7б] ¦пероксидаза¦ ¦ ¦ ¦ ¦ 1,1 ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ (650)¦ КИН ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦ ¦---------+-----------+------+------+-----+-------+-----+------+-------+-------- Примечание. 4-ААП - 4-аминоантипирин; АДГ - альдегиддегидрогеназа; АБТС - 2,2-азиноди-(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота); КИН - кинетический метод Педченко В.В., Малахов В.Н. Вопросы медхимии. - 1991, N 4, с.85. Удобны и просты для применения в клинической лаборатории ферментные методы определения ХС на бумажных диагностических полосках, многослойных элементах, пленках, содержащих все необходимые компоненты реакционной среды. Как и при анализе других компонентов сыворотки крови методами сухой химии, анализируемая сыворотка без предварительного разбавления наносится на пленку и через 5 мин с использованием специально сконструированных для этих целей фотометров измеряется интенсивность окрашивания, пропорциональная концентрации ХС. Широкое распространение такой способ анализа ХС получил с выпуском фирмой "Boehringer Manheim" фотометра "Reflotron", измеряющего интенсивность окрашивания в отраженном свете, и полосок "Reflotron-Cholesterol", которые позволяют за 45 с определять ХС не только в сыворотке, но и в цельной крови. В качестве референтного метода количественного определения общего холестерина в сыворотке и плазме H.Derks и соавт. предложен метод, основанный на газохроматографическом разделении триметилсилильных эфиров холестерина, высокая специфичность которого достигнута за счет использования капиллярных колонок. Аналитические потери откоррегированы с помощью метода внутреннего стандарта. Выделение добавленного холестерина было полным - 99,99%, среднее квадратичное отклонение 0,48%, коэффициент вариации 0,35-0,50%. Оборудование: газовый хроматограф модель 3700, Varian Palo Alto СА с пламенно-ионизационным детектором. Стандартный материал и реактивы: RSM 911а, чистота 99,8%. Для превращения в летучие производные использовали NO-bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide и пиридин в соотношении 1:2. Правильность результатов, полученных с помощью референтного метода, можно проверить только окончательным методом, при котором проводят измерение концентрации точно определяемых атомов, ионов. Американской ассоциацией клинической химии и Национальным бюро стандартов предложен метод определения содержания общего холестерина, основанный на изотопном разведении - масс-спектрометрии. Холестерин-D7 добавляют к сыворотке и при этом поддерживают соотношение холестерина-D7 и общего холестерина (по массе) 1:1. Перед проведением анализа методами хроматографического разделения и масс-спектрометрии холестерин этерифицируют бис-триметилсилилацетамидом. Соотношение интенсивности молекулярных ионов (465 и 458) измеряют для каждой пробы и двух калибровочных смесей. Весовое соотношение для каждой пробы определяют с помощью линейной интерполяции соответственной ионной интенсивности и вычисляют общий холестерин. Специфичность данного метода заключается в том, что интерполяция при других массах отсутствует. Статистический анализ показал, что для данного метода в серии исследований получен коэффициент вариации, равный 0,17%, а изо дня в день он равен 0,36%. Оборудование: масс-спектрометр с мультиионным селектором модель СН-7А (Varian МАТ, Florham Park N. J. 07932), газовый хроматограф модель 2740. Стандартный материал: RSM 911 а, Национальное бюро стандартов, cholesterol-D [cholest-5-en-3-ol (З в )], cholesterol-D7 [cholest-5-en-25, 26, 26, 26, 27, 27,27-d7-3о1 (Зв)], полученный из научной лаборатории (Ins, State College РА 16801). Для превращения в триметилсилильные эфиры используют бис(триметилсилил) ацетамид. ------------------------------- в - греческая буква "бета". Результаты проверки газохроматографического метода методом изотопного разведения - масс-спектрометрии - лежат в пределах 95% доверительного интервала, вычисленного для средних концентраций, т.е. газохроматографический метод имеет отклонения более чем на 0,4% от метода изотопного разведения - масс-спектрометрии. Одна из причин этого заключается в том, что в газохроматографическом методе не до конца идет процесс гидролиза. При анализе перспективных хроматографических методов определения холестерина следует подчеркнуть широкие возможности высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). При разделении методом ВЭЖХ исключается сложный этап превращения холестерина в летучее производное, необходимый при газовой хроматографии, что сокращает время, необходимое для анализа. В литературе нет сведений о том, что метод ВЭЖХ предлагают в качестве референтного, но его можно использовать в клинических лабораториях как высокочувствительный и специфичный. 10.З. Определение концентрации холестерина, связанного с липопротеинами различной плотностиНа практике общий холестерин является приемлемой заменой холестерина липопротеинов низкой плотности (во всяком случае является удовлетворительной приблизительной оценкой его уровня). Но без сомнения, оценка риска (предсказание исхода) делается более точной при добавлении содержания холестерина липопротеинов высокой плотности (ХС-ЛПВП) и отношения содержания общего холестерина и холестерина липопротеинов высокой плотности. ХС-ЛПВП ниже 1 ммоль/л (39 мг/дл) у мужчин и ниже 1,1 ммоль/л (43 мг/дл) у женщин увеличивает общий риск при любых уровнях других липидов. Кроме того, на повышенный риск указывает отношение общий холестерин/холестерин ЛПВП равное или превышающее 5. Это отношение особенно полезно вычислять и использовать для определения терапевтической тактики у людей с содержанием холестерина между 5 и 6,5 ммоль/л (200-250 мг/дл). Во втором докладе Комитета экспертов по выявлению, оценке и лечению повышенного уровня ХС в крови у взрослых США, у лиц без ИБС рекомендуется поддерживать уровень общего ХС ниже 200 мг/дл (или 5,2 ммоль/л) или уровень ХС ЛПНП ниже 130 мг/дл (или 3,4 ммоль/л). У больных ИБС уровень ХС ЛПНП, согласно рекомендациям Комитета экспертов, не должен превышать 100 мг/дл (или 2,6 ммоль/л). В то же время лаборатории до настоящего времени не располагают стандартизованным методом определения ХС-ЛПНП; нет референтного метода и у липидологов. Определение ХС-ЛПНП включает ультрацентрифугирование (флотацию ЛПОНП), преципитацию ЛПНП и определение ХС в оставшихся ЛПВП. Альтернативные варианты определения ХС-ЛПНП основаны на селективной преципитации полианионами, иммунохимическом связывании, хроматографии и электрофорезе. Все методы обладают невысокой специфичностью, особенно при высоком содержании ЛПОНП. В настоящее время метод ультрацентрифугирования в клинической биохимии используют редко и для определения, вернее расчета, ХС-ЛПНП применяют формулу, предложенную W.Friedwald и соавт. Формула позволяет получать достоверные результаты при содержании триацилглицеринов (ТГ) - не выше 200 мг% (норма ниже 160 мг%). ХС - ЛПНП = ХС общий - (ХС-ЛПВП+ТГ/5). Для расчета величины ХС-ЛПНП согласно этой формуле необходимо измерить ХС и ТГ сыворотки крови, определить ХС-ЛПВП, т.е. оценить многие стороны обмена ЛП. Это приводит к большим вариациям уровня ХС-ЛПНП в отдельных регионах, даже лабораториях (до 20%). Возможно, достоверность ХС-ЛПНП как фактора риска связана с комплексным формированием этой величины. В то же время даже косвенное определение ХС-ЛПНП не поддается стандартизации. Это связано с отсутствием первичного стандарта и референтного метода. Ферментные аналитические системы с успехом используют при определении содержания ХС в отдельных классах липопротеинов, полученных из сыворотки (плазмы) крови ультрацентрифугированием, электрофорезом, различными преципитационными методами разделения липопротеинов. Так, широкое применение нашло определение концентрации ХС-ЛПВП ферментными методами в надосадочной жидкости после осаждения ЛПНП и ЛПОНП в присутствии катионов двухвалентных металлов и полианионов, фосфовольфрамовой кислоты, декстрансульфата, полиэтиленгликоля и гепарина. Ферментативный анализ ХС-ЛПВП после осаждения ЛПОНП и ЛПНП с помощью гепарин-марганцевой смеси может приводить к получению завышенных результатов вследствие взаимодействия ионов марганца с компонентами индикаторной системы, а также мутности реакционной среды, образующейся в результате взаимодействия этих ионов с другими компонентами реакционной смеси. Предлагали удалять из надосадочной жидкости ионы марганца в виде нерастворимой гидроокиси, добавляя в пробы перед измерением ХС бикарбонат натрия. Другие авторы предлагают в тех же целях добавлять в реакционную смесь ЭДТА. В качестве референтного предлагают метод, в основе которого лежит двухэтапное центрифугирование или комбинация одного этапа ультрацентрифугирования и осаждения. Разделение липопротеинов, в основе которого лежит различие в их плотности, проводят центрифугированием в градиенте плотности растворов NaCl, NaCl - NaBr, KBr. Таким образом можно выделить 4 фракции липопротеинов: очень низкой плотности 1,006; низкой плотности (1,006-1,063); 2 фракции высокой плотности (1,063-1,125 и 1,125 - 1,210), используя препаративные ультрацентрифуги фирмы Beckmann Instruments, Fullerton СА или модель Ultra Clear Beckmann Instruments Munich F.R.G. Нижняя граница уровня ХС-ЛПВП в крови составляет в зависимости от примененного метода 26-35 мг/дл. К тому же различие среднего уровня ХС-ЛПВП (50 мг/дл) в популяции и нижней границы (35 мг/дл) не является уже столь значительным при рассмотрении индивидуальных данных, так как воспроизводимость метода невысока и его трудно стандартизировать. Липопротеины высокой плотности состоят из двух субклассов ЛПВП2 и ЛПВП3. Реально рассматривать оба субкласса ЛПВП с позиций фактора антириска коронарного атеросклероза. У членов семей с наследственной гипер-ЛПВП основная масса ХС крови сосредоточена в ЛПВП2, а при злоупотреблении алкоголем - в ЛПВП3. В эпидемиологических исследованиях ХС-ЛПВП2 является более достоверным фактором антириска коронарного атеросклероза по сравнению с ХС-ЛПВП3. В условиях гипертриацилглицеринемии преимущественно снижается уровень ХС-ЛПВП2. Вместе с тем и до настоящего времени нет единого метода определения ХС-ЛПВП2, не отработана методика стандартизации. Главное состоит в том, что прежде чем говорить о ХС-ЛПВП2 как о факторе антириска, необходимо выяснить физиологическое значение ЛПВП2, уметь стандартизованно оценивать его уровень. 10.4. Определение содержания триацилглицеринов в кровиСуществуют два способа определения содержания триацилглицеринов (ТГ) в сыворотке крови: химический и ферментативный. Каждый из них включает многочисленные модификации. В настоящее время определение ТГ можно провести, основываясь на принципе "сухой химии", при использовании разной технологии - импрегнированные волокна (фирма "Miles", США; "Boehringer Mannheim", Германия) и мембранная технология (фирма "Kodak", США). Содержание ТГ, определенное в плазме крови, на 2-4 мг/дл ниже, чем в сыворотке. Это обусловлено разведением плазмы крови за счет внутриклеточной жидкости, теряемой эритроцитами при действии антикоагулянтов; флюорид, цитрат и оксалат вызывают значительную потерю жидкости эритроцитами. В качестве антикоагулянта при определении ТГ предпочтительно использовать ЭДТА (1 мг на 1 мл цельной крови). Комплексон связывает тяжелые металлы, ингибируя активность липолитических ферментов. Во избежание разбавления плазмы крови желательно центрифугировать образцы и отделить полученную плазму в течение короткого времени. В отличие от ХС прямые химические методы (без предварительной экстракции органическим растворителем) определения ТГ неприемлемы, так как в сыворотке крови присутствуют многие вещества, которые при гидролизе также образуют глицерин. К ним относятся фосфолипиды и глюкоза. Химические методы определения ТГ включают экстракцию органическими растворителями (хлороформ, изопропанол), очистку экстракта адсорбентами (силикагель, сернокислая медь, карбонат кальция) с целью связывания фосфолипидов и удаления моносахаридов. ТГ в экстракте омыляют гидроокисью калия. Образованный глицерин определяют несколькими химическими методами. При окислении глицерина при действии перйодата образуется формальдегид. Определение формальдегида проводят несколькими способами. В реакции с хромотроповой и серной кислотами формальдегид образует хромоген малинового цвета с максимумом абсорбции при длине волны 570 нм. Формальдегид может быть определен и в реакции Хетча, когда при взаимодействии с ацетил-ацетоном и ацетатом аммония образуется гетероциклическое соединение 3,5-диацетил-1,4-дигидролютидин, которое можно определить колориметрически при длине волны 412 нм или флюорометрически (возбуждение 400 нм, испускание 485 нм). Указанный флюорометрический метод и метод определения ТГ с хромотроповой кислотой используют в качестве референтных. Химические методы определения ТГ часто выполняют вручную; метод определения ТГ в реакции с ацетил-ацетоном, основанный на флюорометрии, адаптирован для автоанализатора модели АА-II, фирма "Technicon", США. Ферментные методы определения ТГ основаны на определении глицерина в сопряженных ферментативных реакциях после гидролиза ТГ липазой. В условиях ферментативного гидролиза ТГ не происходит освобождения глицерина из фосфолипидов и глюкозы. Разрушение ЛП-комплексов, гидролиз ТГ проводят в присутствии детергентов, липазы и протеазы. Роль протеаз в деструкции белок-липидных комплексов не является окончательно установленной, однако а -химотрипсин является компонентом многих наборов реактивов. ------------------------------- а - греческая буква "альфа". Основными сложностями определения ТГ-ферментными методами являются неполная деструкция ЛП-комплексов и частичный гидролиз (освобождение глицерина), ТГ, содержащие преимущественно насыщенные или ненасыщенные жирные кислоты (ЖК), гидролизуются при действии липазы с разной скоростью; соотношение коротко- и длинноцепочечных ЖК также влияет на скорость гидролиза ТГ. Использование ферментного метода позволяет избежать применения органических растворителей, очистки экстрактов для удаления интерферирующих соединений, использования концентрированной гидроокиси калия и проведения гидролиза при высокой температуре. По сравнению с химическими ферментный метод определения ТГ обладает более высокой специфичностью, его легко автоматизировать. Возможность последовательного определения содержания ХС и ТГ в одной кювете дает и большие экономические преимущества. Поскольку определение содержания ТГ в крови основано на определении глицерина, необходимо помнить о наличии свободного глицерина в сыворотке крови. При уровне ТГ ниже 250 мг/дл содержание глицерина не оказывает влияния на результаты исследования. Накопление глицерина в сыворотке крови происходит при сахарном диабете, патологии печени, острой и хронической почечной недостаточности, гемодиализе, приеме нитроглицерина, терапии гепарином. Острые инфекции, состояние стресса, лекарственные препараты, оказывающие липолитическое действие, значительно увеличивают содержание глицерина в крови. Спонтанный гидролиз ТГ имеет место в сыворотке крови при длительном хранении образцов. Если определение ТГ невозможно провести в течение 2 сут, сыворотку крови следует хранить при температуре -20 град. С. При определении ТГ нерешенным вопросом является выбор стандарта. Для получения точных данных необходимо использовать первичный стандартный раствор, раствор ТГ в органических растворителях. Для приготовления стандартного раствора обычно используют триолеин, хотя смесь триолеина и трипальмитина (2:1 по весу) более сходна по степени ненасыщенности ЖК с ТГ человека. В качестве стандартного раствора ТГ можно использовать оливковое масло, которое по инфракрасному спектру сходно с триолеином. Стандартный раствор триолеина в изопропаноле подходит только для химических методов. При ферментных методах определения ТГ используют водные стандартные растворы глицерина. Основной недостаток их состоит в том, что содержание глицерина не отражает вариации, возникающие на этапах экстракции, адсорбции и омыления. Кроме того, по вязкости водные растворы глицерина отличаются от сыворотки крови. Растворы глицерина можно использовать для проверки воспроизводимости метода, линейности реакции. При определении ТГ ферментным методом наиболее часто используют калибраторы - сыворотку крови человека, содержание ТГ в которой определено референтными методами при использовании первичного стандартного раствора. В качестве контрольного материала могут быть применены контрольные сыворотки или внутрилабораторные пулы. Содержание ТГ в сыворотке крови при разных патологических состояниях меняется в значительных пределах. Поскольку линейность каждого метода имеет ограничения, следует помнить, что точность определения ТГ как при низких (<30 мг/дл), так и при высоких (>400 мг/дл) значениях снижается. При определении ТГ ферментными методами исследования пробы с высокими значениями желательно повторить, уменьшив объем сыворотки. При определении ТГ химическими методами липидный экстракт можно также брать в меньших количествах. Учитывая большую долю патологических результатов для ТГ, в практической работе следует использовать контрольные сыворотки с нормальным и повышенным содержанием липидов. 10.5. Измерение содержания жирных кислот в кровиРоль строительных блоков холестерина и других классов липидов играют жирные кислоты, содержание которых изменяется у больных инфарктом миокарда, адренолейкодистрофией, атеросклерозом, что используется в качестве дополнительного диагностического теста. Изменение состава жирных кислот является основой диагностики синдрома Рефсума и энтеропатического акродерматита. В настоящее время отсутствуют не только референтный метод и стандартные референтные материалы для определения жирных кислот в крови, но и унифицированный метод. Среди различных методов, которые предлагается использовать для определения жирных кислот в клинических лабораториях, можно выделить ферментативный, основанный на активации и превращении свободных жирных кислот в ацетил-КоА в присутствии Mg и АТФ. Значительная ошибка измерений связана с тем, что ацил-КоА-синтетаза не может атаковывать все свободные жирные кислоты, присутствующие в сыворотке, так как большой процент свободных жирных кислот связан с белком и их реакционная способность по отношению к ферменту окончательно не выяснена. Жирные кислоты, добавленные к сыворотке или плазме, могут вести себя не идентично эндогенным жирным кислотам, следовательно, возможность оценки правильности метода с помощью введения стандартных веществ исключается. В связи с этим нет необходимости обсуждать результаты количественного анализа, не сравнивая с другими методами. Ферментативный метод специфичен при определении жирных кислот с длиной цепи С6-С20, но не дает информации об изменениях в содержании ненасыщенных жирных кислот. Для количественного определения полиненасыщенных жирных кислот в клинических лабораториях предлагают метод, основанный на окислении двойных связей атмосферным кислородом в присутствии липоксидазы. Субстратом для липоксидазы являются линолевая, линоленовая, арахидоновая кислоты, более того, линолевая кислота используется для определения данного фермента. Метод имеет ограниченные возможности по отношению к широкому спектру ненасыщенных жирных кислот, например, 8,14-экзодиеновая, 5,8,11-экзотриеновая, 8,11,14-докозатриеновая кислоты не подвергаются окислению в присутствии липоксидазы, а этерифицированные кислоты реагируют, но крайне медленно. Вышеописанными методами не представляется возможным определять некоторые группы жирных кислот, например летучие, а также индивидуальные жирные кислоты, которые являются диагностически значимыми, например линолевая, арахидоновая, фитановая кислоты. Метод газожидкостной хрокатографии является универсальным методом, с помощью которого можно разделить смесь летучих насыщенных, моно- и полиненасыщенных жирных кислот. Экспресс-диагностику анаэробной инфекции осуществляют путем идентификации летучих жирных кислот методом газожидкостной хроматографии. Перед хроматографическим разделением высших жирных кислот необходимо получить летучие производные, для этого используют такие метилирующие агенты, как диазометан, хлористый ацетил или метаноловый раствор трехфтористого бора. Для хроматографического разделения необходимы стеклянные колонки. В качестве наполнителя используют хроматон N-AW-DMC или хромосорб W-AW-DMC с нанесенной полярной жидкой фазой, например полиэтиленгликольсукцинат, полиэтиленгликольадипат, полидиэтиленгликольсукцинат, полиэтиленгликольадипинат. В качестве внутреннего стандарта для расчета абсолютного количества идентифицированных жирных кислот используют маргариновую кислоту. Таким образом можно определять как свободные жирные кислоты, так и полученные в результате гидролиза. Все экстрагируемые липиды гидролизуются одновременно, а происхождение продуктов гидролиза можно определить, если предварительно разделить экстракт методом тонкослойной хроматографии на фракции (холестериновые эфиры, триацилглицерины, свободные жирные кислоты, холестерин-диацилглицерины, фосфолипиды-моноацилглицерины), элюировать их и проводить анализ отдельных фракций. 10.6. Исследование апопротеинов кровиВ последние годы обмен липопротеинов (ЛП) исследуют путем определения не только липидов, но и белков. Это касается выявления в крови специфических транспортных белков липидов - аполипопротеинов. Апобелки ответственны за формирование ЛП, метаболические превращения их в сосудистом русле и катаболизм липидов после рецепторзависимой интернализации ЛП клетками. Критериями для определения аполипопротеинов в качестве факторов риска являются высокая степень ассоциации с коронарным атеросклерозом в эпидемиологических и клинических исследованиях, независимость физиологического действия аполипопротеинов отдельных классов, яркая клиническая картина коронаросклероза в случае генетических нарушений апопротеинов, возможность точного определения, независимые изменения отдельных аполипопротеинов в процессе гиполипидемической терапии. Из всех апобелковых тестов лучшим показателем риска коронарного атеросклероза является содержание в крови аполипопротеина В (апоВ), основного белка, формирующего все богатые триацилглицеринами и ХС ЛП (ЛПОНП, ЛППП, ЛПНП). Определение апоВ проводят способами, применимыми для исследования специфичных белков, методами турбидиметрии и нефелометрии при использовании простых фотометров, многоканальных биохимических анализаторов, нефелометров. Для определения апоВ годятся поликлональные антисыворотки. Несмотря на высокое диагностическое значение теста, для апоВ не отработана система стандартизации. Восемь фирм производят индивидуальные калибраторы для апоВ и совместно с исследователями прилагают усилия для отработки вторичного стандарта. Исследования показали, что существование ЛПВП2 и ЛПВП3 обусловлено наличием в апоА двух апобелков: апоА-I и апоА-II. Из них только апоА-I является достоверным антифактором риска. С точки зрения стандартизации, для апоА-I нет столь больших сложностей, как для апоВ. Для внедрения биохимического теста в практику как показателя фактора риска нужно, чтобы метод определения показателя был легко и быстро выполнимым, воспроизводимым и правильным, приемлемым для автоматизации, требующим минимальное количество сыворотки, недорогим. Всем перечисленным условиям удовлетворяет определение апоВ и апоА-1, однако отсутствие в настоящее время стандартизации исследования апобелков приводит к тому, что в крови мужчин содержание апоА-1 колеблется от 110+14 до 161+30 мг/дл. Естественно, что при таких вариациях нормы диагностическая оценка данных не является столь однозначной. РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА1. Гаранина Е.Н. Выбор методов внутрилабораторного контроля качества исследований. В кн.: Клиническая лабораторная диагностика. Состояние и перспективы. - Санкт-Петербург, 1996, с.59-61. 2. Гольдфильд Р.С., Китаина С.С. Некоторые формы организации контроля качества. Лабор. Дело, 1981, N 10, с.628-631. 3. Колб В.Г., Коваленко И.Е. Опыт проведения контроля качества лабораторных исследований в Белорусской ССР. В кн.: Лабораторная диагностика. Тезисы II Всесоюзного съезда врачей-лаборантов. Т. Организация лабораторной службы. - М., 1979, с.35-38. 4. Меньшиков В.В., Гаранина Е.Н. Контроль качества клинических лабораторных исследований. Принципы и методы. - М.: Медицина, 1994, 151 с. 5. Меньшиков В.В. Факторы, определяющие качество клинических лабораторных исследований. Клиническая лабораторная диагностика. - М., 1995, N 6, с.7-11. 6. Методические указания "Контроль качества клинических лабораторных исследований (под ред. В.В.Меньшикова), Москва, 1981, 63 с. 7. Методические указания "Контроль качества аппаратуры в клинико-диагностических лабораториях" (под ред. В.В.Меньшикова). - Москва, 1981, 29 с. 8. Ореховский В.М., Важник Н.В., Костин Г.М., Колб В.Г. Принципы формирования национальной структуры службы клинической лабораторной диагностики Республики Беларусь. Клиническая лабораторная диагностика. - М., 1995, N 6, с.59-61. 9. Ошибки в лабораторной диагностике. Под ред.Громашевской Л.Л. - Киев: Здоровье, 1990, 261 с. 10. Приказ N 545 от 23 апреля 1985 г. "О дальнейшем совершенствовании контроля качества клинических лабораторных исследований", Москва, 1985, 62 с. 11. Титов В.Н., Наумова И.Н. Автоматизированный счет форменных элементов крови. Методическое руководство. - М., 1995, 76 с. Приложение 2 ПОЛОЖЕНИЕ О ПОРЯДКЕ ПРОВЕДЕНИЯ ВНУТРИЛАБОРАТОРНОГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА В КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРИЯХ1. Внутрилабораторный контроль качества клинических лабораторных исследований является неотъемлемым элементом любых клинико-лабораторных исследований, осуществляемым с целью обеспечения их достоверности. 2. Внутрилабораторный контроль качества является обязательным условием аккредитации или аттестации клинико-диагностических лабораторий. 3. Внутрилабораторный контроль качества осуществляется ежедневно по каждому виду исследований, выполняемых в лаборатории. 4. Внутрилабораторный контроль качества включает в себя следующие этапы: 4.1. предоставление на лабораторный участок контрольной пробы; 4.2. выполнение исследований в этой пробе; 4.3. оценка результатов контроля; 4.4. при выявлении неудовлетворительных результатов - выбраковка результатов выполняемых исследований и устранение причин погрешности. 5. Контрольные пробы выдаются ежедневно на каждый участок лаборатории старшим фельдшером-лаборантом или заведующим лабораторией. Используются только виды контрольных материалов, разрешенные к применению Госстандартом Республики Беларусь или методы контроля, рекомендуемые методическими указаниями "Контроль качества клинических лабораторных исследований" (приложение 1) и РЦКЛД. 6. Контрольные исследования выполняются только тем сотрудником, который на данный момент выполняет контролируемые исследования, при этом, в учете нагрузки они зачитываются по тем же нормативам, что и плановые исследования. 7. Оценка результатов исследований и их протокольное оформление осуществляется в соответствии с Методическими указаниями "Контроль качества клинико-диагностической лабораторией" или другим сотрудником, на которого приказом по ЛПУ возложена ответственность за работу по контролю качества в лаборатории. 8. При выявлении неудовлетворительных результатов контроля качества по какому-либо из выполняемых исследований, анализ причин погрешностей и их установление осуществляется непосредственным исполнителем или другими сотрудниками по распоряжению заведующего лабораторией в рамках нормативного времени, выделяемого на установку методов. 9. При установлении объективных причин невозможности экспертного установления погрешностей того или иного метода исследований (неисправность оборудования, некачественность реагентов, стандартов или контрольных материалов, отсутствие требуемых условий выполнения метода и др.) исполнение методики прекращается, что документируется соответствующим протоколом, утверждаемым главным врачом ЛПУ с указанием плана мероприятий и сроков устранения погрешностей. 10. При неустановлении причин погрешностей методики силами лаборатории не позднее чем в 3-дневный срок от момента установления погрешности об имеющем место официальным образом информируется врач-лаборант, ответственный за работу по контролю качества лабораторных исследований в регионе. 11. При получении официальной информации о погрешности в исполняемом методе с невозможностью самостоятельного устранения причин врач-лаборант, ответственный за работу по контролю качества в регионе, обязан в 15-дневный срок принять меры к установлению причин и устранению погрешности. При выявлении объективных причин невозможности экстренного устранения погрешности в данной лаборатории исполнение методики прекращается, что документируется соответствующим протоколом, утвержденным главным специалистом региона по клиническим лабораторным исследованиям. Главным специалистом составляется план мероприятия по устранению погрешности с указанием ответственных лиц и сроков устранения, утверждаемый начальником УЗ региона. При невозможности самостоятельного установления причин погрешности главный специалист по клинической лабораторной диагностике информирует РЦКЛД. 12. По всем вопросам обеспечения и осуществления внутрилабораторного контроля качества ответственность несет заведующий лаборатории. Начальник Главного управления медицинской помощи А.К.ЦЫБИН Приложение 3 ПОЛОЖЕНИЕ О ПОРЯДКЕ ПРОВЕДЕНИЯ ВНЕШНЕГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА В КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРИЯХ, ОРГАНИЗУЕМОГО РЦКЛД (НАЦИОНАЛЬНОЙ СИСТЕМЕ ВНЕШНЕГО КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА КЛИНИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ)1. Внешний (межлабораторный) контроль качества клинических лабораторных исследований является неотъемлемым элементом деятельности клинико-диагностических лабораторий, осуществляемым с целью обеспечения преемственности и сопоставимости результатов клинико-лабораторных исследований на всей территории республики и с целью признания их за рубежом. 2. Участию в национальной системе внешнего контроля качества подлежат все клинико-диагностические лаборатории Республики, независимо от ведомственного подчинения и форм собственности. Клинико-диагностические лаборатории ведомственного подчинения и негосударственных форм собственности участвуют во внешнем контроле качества на договорной основе. Договор заключается с Минским (Республиканским) диагностическим центром по согласованию с Минздравом. Клинико-диагностические лаборатории прямого подчинения Минздрава участвуют в системе внешнего контроля качества на основе действующей системы финансирования. 3. Участие в национальной системе контроля качества является обязательным условием аккредитации или аттестации клинико-диагностических лабораторий. 4. Основой национальной системы внешнего контроля качества является бесперебойное функционирование внутрилабораторного контроля качества. 5. Национальная система внешнего контроля качества включает в себя 3 уровня: 1. региональный; 2. республиканский; 3. международный. 6. Региональный уровень внешнего контроля качества представляет собой ежеквартальное (4 раза в год) осуществление контроля качества клинических лабораторных исследований каждой клинико-диагностической лаборатории региона по всем видам исследований, проводимое врачом-лаборантом, ответственным за работу по контролю качества в регионе. В клинико-диагностических лабораториях областей эта работа осуществляется врачом-лаборантом, ответственным за работу по контролю качества в области. В клинико-диагностических лабораториях республиканского подчинения и г.Минска эта работа осуществляется врачом-лаборантом РЦКЛД, ответственным за работу по контролю качества в республике. 7. Республиканский уровень внешнего контроля качества представляет собой ежегодное (1 раз в год) осуществление РЦКЛД контроля качества клинических лабораторных исследований в каждой лаборатории республики по каждому виду исследований, выполняемых лабораторией. 8. Международный уровень внешнего контроля качества представляет собой участие РЦКЛД и других национально значимых лабораторий в международных системах контроля качества. Осуществляется на основе договоров с соответствующей международной системой контроля качества, по согласованию с Минздравом. 9. Внешний контроль качества включает в себя следующие этапы: 1. доставка контрольного материала в лабораторию из контрольного центра; 2. выполнение исследований в контрольной пробе; 3. оформление протокола контрольного исследования; 4. отсылка протокола исследования в контрольный центр для оценки результатов контроля; 5. оценка результатов контроля; 6. информация контролируемой лаборатории о результатах контроля; 7. при выявлении неудовлетворительных результатов - остановка действия методики и устранения причин погрешности. 10. Контрольные пробы при внешнем региональном контроле предоставляются контролируемой лаборатории врачом-лаборантом, ответственным за контроль качества в регионе. Используются только контрольные материалы, разрешенные к применению Госстандартом Республики Беларусь. 11. Контрольные пробы при внешнем республиканском контроле качества предоставляются в контролируемые лаборатории врачом-лаборантом, ответственным за контроль качества в Республике, через врачей-лаборантов, ответственных за контроль качества в регионе. 12. Контрольные исследования выполняются только тем сотрудником, который на данный момент выполняет контролируемые исследования, при этом, в учете нагрузки они зачитываются по тем же нормативам, что и плановые исследования. 13. Протокол контрольного исследования оформляется заведующим контролируемой лаборатории и отсылается в адрес врача-лаборанта, ответственного за контроль качества в регионе при внешнем региональном контроле, и в адрес РЦКЛД при внешнем республиканском контроле не позднее чем через сутки от момента проведения исследования. 14. Оценка результатов исследований регионального контроля осуществляется врачом-лаборантом, ответственным за контроль качества по региону, по факту получения ответа каждой лаборатории и суммарно по региону ежеквартально и по итогам года. Оценка результатов исследований республиканского контроля осуществляется врачом-лаборантом РЦКЛД, ответственным за контроль качества, по факту получения ответа каждой лаборатории, и суммарно по республике по итогам года. 15. Процедура доставки контрольной пробы в лабораторию, оформление документации исследования, оценка результатов исследования, ее документальное оформление и процедура отсылки протокола осуществляется в соответствии с Методическими указаниями "Контроль качества клинических лабораторных исследований". 16. Суммарная оценка результатов контроля качества ежеквартально и ежегодно при региональном контроле качества и ежегодно при республиканском контроле качества оформляется в виде бюллетеня с оценкой "удовлетворительно" и "неудовлетворительно" и ранжированием лабораторий в рамках этих оценок по степени достоверности результата. Бюллетени доводятся каждому пользователю. Данная система оценки направлена на совершенствование качества лабораторных исследований в клинико-диагностических лабораториях и, в соответствии с международными нормами, не является основанием для административных и других видов наказания. 17. При выявлении неудовлетворительных результатов регионального контроля качества по какому-либо из исследований в контролируемой лаборатории врач-лаборант, ответственный за контроль качества в регионе, обязан в течение 24 часов от момента получения протокола известить контролируемую лабораторию о необходимости прекращения данного исследования и принятия мер к выяснению причин его погрешности. Дальнейшие действия лаборатории, в которой выявлен неудовлетворительный результат, определяются положением о порядке проведения внутрибольничного контроля качества. При самостоятельном устранении причин погрешности контролируемая лаборатория обязана в 3-дневной срок проинформировать регионального врача по контролю качества. 18. При выявлении неудовлетворительных результатов республиканского контроля качества врач-лаборант РЦКЛД, ответственный за контроль качества, обязан в течение 24 часов от момента получения протокола известить контролируемую лабораторию и врача-лаборанта, ответственного за контроль качества в регионе, о факте погрешности и необходимости принятия мер к его ликвидации в рамках действий, описанных в пункте 17 данного Положения. 19. РЦКЛД в течение 15 суток от момента получения информации о невозможности самостоятельного установления погрешности по какому-либо методу исследований в какой-либо из контролируемых лабораторий на региональном уровне обязан принять меры к установлению причин погрешностей и их устранению. При выявлении объективных причин невозможности экстренного устранения погрешностей составляется соответствующий протокол с указанием плана мероприятий, сроков устранения погрешностей и ответственных лиц, согласуемый с руководителем РЦКЛД и утверждаемый руководителем УЗ региона (или ЛПУ республиканского подчинения). 20. По всем вопросам обеспечения и осуществления внешнего контроля качества регионального уровня ответственность несет главный специалист по клинической лабораторной диагностике региона. 21. По всем вопросам обеспечения и осуществления внешнего контроля качества республиканского уровня ответственность несет руководитель РЦКЛД. 22. Ежегодные отчеты врача, ответственного за контроль качества, о действии регионального внешнего контроля качества, согласованные с главным специалистом по клинической лабораторной диагностике региона и утвержденные начальником УЗ региона, предоставляются в РЦКЛД не позднее 1 февраля. 23. Отчеты о действии республиканской системы КК, с учетом данных регионального контроля качества, ежегодно предоставляются РЦКЛД в Главное управление медицинской помощи Министерства здравоохранения не позднее 1 марта. 24. Ежегодные итоги внешнего контроля качества регионального и республиканского уровней рассматриваются на соответствующих региональных и республиканских рабочих семинарах специалистов клинической лабораторной диагностики. Начальник Главного управления медицинской помощи А.К.ЦЫБИН |
Новости законодательства
Новости Спецпроекта "Тюрьма"
Новости сайта
Новости Беларуси
Полезные ресурсы
Счетчики
|
