ПОИСК ДОКУМЕНТОВ

Постановление Главного государственного санитарного врача Республики Беларусь от 10.03.2006 № 30 "Об утверждении Инструкции "Организация профилактических и противоэпидемических мероприятий при возникновении птичьего гриппа"

Текст документа с изменениями и дополнениями по состоянию на ноябрь 2013 года

< Главная страница

В связи с обострением эпизоотической и эпидемиологической ситуации по гриппу птиц, а также реальной угрозой заноса инфекции на территорию Республики Беларусь, связанной с миграцией птиц, в соответствии с Законом Республики Беларусь от 23 ноября 1993 г. "О санитарно-эпидемическом благополучии населения" (в редакции Закона Республики Беларусь от 23 мая 2000 г.) ПОСТАНОВЛЯЮ:

1. Утвердить Инструкцию "Организация профилактических и противоэпидемических мероприятий при возникновении птичьего гриппа".

2. Главным государственным санитарным врачам областей и г.Минска довести до всех заинтересованных лиц и установить контроль за его исполнением.

3. Контроль за исполнением настоящего постановления возложить на Первого заместителя Главного государственного санитарного врача Мазик М.М.

Главный государственный

санитарный врач

Республики Беларусь М.РИМЖА

                                           УТВЕРЖДЕНО
                                           Постановление
                                           Главного государственного
                                           санитарного врача
                                           Республики Беларусь
                                           10.03.2006 N 30

Раздел I ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

Глава 1 ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ

1. Грипп птиц является высококонтагиозной вирусной инфекцией, поражающей все виды пернатых. Наиболее чувствительными являются куры и индюки. Естественным резервуаром для вируса гриппа птиц (ВГП) являются водоплавающие птицы. Дикие виды водоплавающих птиц в силу естественной резистентности сами не заболевают и способны в процессе миграции переносить вирус на значительные расстояния. ВГП антигенной формулы H5N1 за последние годы в результате мутаций приобрел не только способность преодолевать межвидовой барьер, но и вызывать чрезвычайно тяжелые клинические формы заболеваний людей, значительная часть которых заканчивается летально. В анамнезе всех заболевших отмечается тесный контакт с заболевшей птицей.

2. Все работы с образцами, подозрительными на содержание живого вируса гриппа A (H5N1), проводятся в соответствии с требованиями санитарных правил СП 1.2.011-94 "Безопасность работы с микроорганизмами I, II групп патогенности".

3. Комплекс профилактических и противоэпидемических мероприятий должен обеспечивать готовность организаций здравоохранения и органов государственного санитарного надзора к предотвращению заноса ВГП A (H5N1) и работе в случае возникшего очага инфекции.

Глава 2 ЭПИДЕМИОЛОГИЯ ГРИППА ПТИЦ

4. В настоящее время высокопатогенный ВГП A (H5N1) расширил свой географический ареал и определяется не только в странах Юго-Восточной Азии, но и в Европе, странах Карибского бассейна, Африке, следуя по путям сезонной миграции птиц околоводного комплекса. По прогнозу института зоологии НАН Республики Беларусь, занос вируса гриппа A (H5N1) на территорию республики птицами околоводного комплекса возможен во время весенней миграции.

5. Механизм передачи вируса аэрогенный, а также через различные биологические жидкости (материалы) от больных птиц.

6. Инкубационный период при гриппе A (H5N1) составляет обычно 2 - 3 дня с колебаниями от 1 до 7 дней. Заболевание начинается остро с озноба, миалгии, возможны боли в горле, ринорея, в четверти случаев отмечается повторная рвота. Повышение температуры тела до 38 град. C и выше является одним из ранних симптомов.

7. При регистрации случая ВГП необходимо руководствоваться следующими определениями, предложенными Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ):

7.1. Подтвержденный случай гриппа A (H5N1) - случай гриппа А (H5N1), прижизненный или посмертный, при котором лабораторное тестирование дает один или более следующих результатов:

- выделение вируса A (H5N1) в культуре клеток;

- положительные результаты полимеразной цепной реакции (ПЦР) на А(Н5Ш);

- положительный иммунофлуоресцентный анализ на Н5-антиген с использованием Н5-моноклональных антител;

- 4-кратное повышение титра специфических антител в парных образцах сыворотки заболевших.

7.2. Возможный случай гриппа A (H5N1) - А. Любое лицо с лихорадкой (t >= 38 град. C) в сочетании с одним или несколькими из следующих симптомов: кашель, боль в горле, поверхностное дыхание, при наличии в анамнезе одного из следующих фактов:

- лабораторно подтвержденный грипп А, однако вирус не удается субтипировать;

- наличие контакта в течение 7 дней до появления симптомов с лицом с подтвержденным случаем гриппа A (H5N1) в период его заразительности, т.е. за день до появления симптомов заболевания и до 7 дня после их появления;

- наличие контакта в течение 7 дней до появления симптомов с птицами, включая цыплят, умершими от гриппа A (H5N1);

- лица, работающие в лаборатории на заборе материалов от заболевших людей или животных с предполагаемой инфекцией, вызванной гриппом птиц A (H5N1) в течение 7 дней до появления симптомов.

Б. Любое лицо, умершее от нерасшифрованного острого респираторного заболевания при наличии в анамнезе одного из следующих фактов:

- проживание в районе, где предполагается или подтвержден грипп птиц;

- наличие контакта в течение 7 дней до появления симптомов с лицом, у которого подтвержден грипп A (H5N1), в инфекционный период.

7.3. Вероятный случай гриппа A (H5N1) - случай заболевания, при котором заболевший имеет лихорадку (t 38 град. C) в сочетании с одним или более из следующих симптомов: кашель, боль в горле, поверхностное дыхание. При этом имеются ограниченные лабораторные свидетельства в пользу гриппа A (H5N1), например Н5-специфические антитела, выявленные в одном из образцов сывороток.

Глава 3 ПОРЯДОК ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ИНФОРМАЦИИ ОРГАНИЗАЦИЯМИ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ

8. Врач или другой медицинский работник организации здравоохранения, установивший или заподозривший случай птичьего гриппа, обязан информировать немедленно главного врача лечебно-профилактической организации.

9. Главный врач лечебно-профилактической организации информирует в течение часа:

- главного врача территориальной организации здравоохранения о сложившейся ситуации, состоянии и лечении больных, необходимой помощи;

- главного государственного санитарного врача административной территории или иного ответственного работника территориального центра гигиены и эпидемиологии о сложившейся ситуации, состоянии больных (степени тяжести).

10. Главный врач территориальной организации здравоохранения информирует не позднее 2-х часов начальника управления здравоохранения областного исполнительного комитета (председателя Комитета по здравоохранению Минского городского исполнительного комитета) и районный (городской) отдел МЧС.

11. Начальник управления здравоохранения областного исполнительного комитета (председатель Комитета по здравоохранению Минского городского исполнительного комитета) в течение 3-х часов подает информацию в управление организации медицинской помощи Министерства здравоохранения Республики Беларусь, а также в областное управление МЧС.

Глава 4 ПОРЯДОК ПРЕДСТАВЛЕНИЯ ИНФОРМАЦИИ ОРГАНИЗАЦИЯМИ ГОСУДАРСТВЕННОГО САНИТАРНОГО НАДЗОРА

12. Главный врач территориального центра гигиены и эпидемиологии информирует о случае птичьего гриппа не позднее 2-х часов с момента получения информации областной центр гигиены и эпидемиологии и общественного здоровья (Минский городской центр гигиены и эпидемиологии), районный (городской) отдел МЧС, а также местные органы власти. Последующая информация уточняется до нормализации ситуации 2 раза в день на 8.30 и 17.00.

13. Главный врач областного центра гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья (Минского городского центра гигиены и эпидемиологии) информирует, не позднее 3 часов с момента получения сообщения, ГУ "Республиканский центр гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья", Главного государственного санитарного врача Республики Беларусь или начальника отдела гигиены, эпидемиологии и профилактики (или главного эпидемиолога) Министерства здравоохранения Республики Беларусь для последующей оперативной информации Министра (или заместителей Министра) здравоохранения Республики Беларусь. Одновременно направляется информация в управление здравоохранения (комитет по здравоохранению) и в управление МЧС областного или Минского городского исполнительного комитета. Последующая информация уточняется 2 раза в день в 9.00 и 17.00 по факсу (017)2784207.

14. Главный врач государственного учреждения "Республиканский центр гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья" обязан обеспечить подачу внеочередной информации немедленно Главному государственному санитарному врачу Республики Беларусь или начальнику отдела гигиены, эпидемиологии и профилактики (или главному эпидемиологу) Министерства здравоохранения Республики Беларусь, а также в МЧС.

Глава 5 ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЕ И ПРОТИВОЭПИДЕМИЧЕСКИЕ МЕРОПРИЯТИЯ, ПРОВОДИМЫЕ ОРГАНИЗАЦИЯМИ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ

15. Медицинские сестры приемных отделений больниц должны оперативно отделять поступающих больных и пациентов с гриппоподобными симптомами в отдельные помещения. В амбулаторно-поликлинических организациях лиц, подозрительных по наличию симптомов заболевания вирусом гриппа птиц, необходимо изолировать в отдельные помещения для проведения обследования и возможной последующей госпитализации.

Вне зависимости от вида и режима работы в организациях здравоохранения должна быть организована временная изоляция больных и пациентов с симптомами птичьего гриппа в отдельной палате (комнате). Комната должна иметь изолированную приточно-вытяжную вентиляцию либо быть изолирована от общеобменной вентиляции, иметь гигиеническое покрытие пола, стен, допускающее влажную дезинфекцию, оснащена кроватью(ями) (в поликлинике - кушеткой), бактерицидным облучателем, отдельным уборочным инвентарем. Двери указанных помещений должны быть уплотнены.

15. Для обследования лиц, подозрительных и больных птичьим гриппом, должен использоваться одноразовый инструментарий. Повторно используемый инструмент, медицинские приборы должны подвергаться обязательной немедленной дезинфекции после использования.

16. Для дезинфекции помещений, поверхностей, инструментов, перчаток и масок должны использоваться дезинфекционные (антисептические) средства широкого спектра действия (фунгицидного, бактерицидного и вирулицидного), зарегистрированные и сертифицированные в республике в установленном порядке, в соответствии с инструкциями по применению.

17. Посещения больных должны быть запрещены при поступлении информации о выявлении больных на территории республики.

18. Перемещения персонала и пациентов в отделениях и между ними должны быть максимально ограниченными.

19. Во всех организациях здравоохранения вводится постоянное ношение персоналом, непосредственно обслуживающим пациентов и население, четырехслойных марлевых повязок, медицинских шапочек и халатов. Смена масок должна проводиться через каждые 3 часа. Пациенты и больные, подозрительные на наличие симптомов птичьего гриппа, должны быть обеспечены индивидуальными марлевыми 4-слойными марлевыми повязками с организацией их смены через 3 часа.

20. Медицинский персонал должен проводить профилактическую антисептическую обработку рук (защитных перчаток) после осмотра и других манипуляций у подозрительных и больных птичьим гриппом, длительных контактов с любым из пациентов, предметами, которые могут быть контаминированы респираторными секретами.

21. В помещениях приема пациентов, временной изоляции подозрительных на заболевание, флюорографических и рентгенологических кабинетах, местах общего пользования проводить профилактическую дезинфекцию поверхностей, предметов обстановки и воздуха не менее 2-х раз в рабочую смену. Поверхности должны подвергаться влажной уборке с применением дезинфицирующих средств соответствующего назначения. После проведения уборки должно проводиться облучение воздуха бактерицидными облучателями, проветривание помещений в течение не менее 10 минут.

22. Стандартные профилактические мероприятия должны применяться при манипуляциях с любыми клиническими отходами. Защитные одежда и приспособления для рук, органов дыхания обязательны при проведении сбора инфицированных отходов и манипуляциях, связанных с их перемещением. Для сбора острых предметов должны использоваться непрокалываемые емкости с соответствующей маркировкой. Дезинфекция емкостей для сбора и перемещения отходов, защитных перчаток обязательна при выполнении любых процедур с отходами в отделениях и лабораториях организаций здравоохранения.

23. При выявлении больного птичьим гриппом на дому, на приеме в амбулаторно-поликлинических организациях, стационарах, проводится определение лиц, имевших тесный контакт с заболевшим (члены семьи, проживающие в одной квартире, пациенты, контактировавшие с больным, медперсонал, осуществлявший уход или имевший контакт с биологическим материалом от больного), которые подлежат медицинскому наблюдению в течение 7 дней (мониторинг симптомов заболевания, термометрия, запрещение выхода на работу и посещения общественных мест без разрешения медработника, сокращение контактов с членами семьи, друзьями).

24. При транспортировке больного (подозрительного) на него следует надеть индивидуальную четырехслойную маску. Организовать ее смену через каждые 3 - 4 часа после госпитализации.

25. Должен быть проведен сбор эпидемического анамнеза с обязательным фиксированием в истории болезни (клиника, поездки и контакты с лицами, имевшими клинику гриппоподобного заболевания, контакт с больной птицей или больными в течение последних 7 дней).

26. В отделениях стационарных организаций здравоохранения, где выявлен больной или подозрительный, все остальные контактные подлежат выписке при возможности. Врач проводит с ними инструктаж о первых симптомах заболевания, проведении термометрии и в случаях появления симптомов с подозрением на птичий грипп рекомендует вызов врача на дом. Составляются списки контактных с указанием Ф.И.О., адреса места жительства, контактных телефонов.

27. После госпитализации больного, подозрительного на птичий грипп, в очаге проводится дезинфекция по типу заключительной.

28. Санитарный транспорт, осуществляющий перевозку больного или подозрительного на птичий грипп, подвергается дезинфекции по месту прибытия.

Глава 6 ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЕ И ПРОТИВОЭПИДЕМИЧЕСКИЕ МЕРОПРИЯТИЯ, ПРОВОДИМЫЕ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОЙ СЛУЖБОЙ

29. После получения информации о случае заболевания (или подозрения) на птичий грипп среди людей или о случае птичьего гриппа у птиц ввести в действие оперативный план по комплексу мер, направленных на локализацию и ликвидацию очага птичьего гриппа, с утверждением в территориальном исполнительном комитете при задействовании различных ведомств, учреждений, организаций.

30. Утвердить приказом главного врача территориального центра гигиены и эпидемиологии состав оперативной бригады специалистов.

31. После получения информации немедленно начать эпидемиологическое расследование случая.

32. Провести сбор эпиданамнеза, обратив особое внимание на наличие следующих обстоятельств:

- поездки за пределы страны и на другие территории внутри страны;

- приезд лиц из других стран или территорий страны;

- контакт с лицами, у которых отмечалась клиника гриппоподобного заболевания;

- контакт с домашней или дикой птицей, как живой, так и павшей.

33. Составить список контактных и организовать медицинское наблюдение за ними в течение 7 дней.

34. Организовать проведение подворных обходов для выявления больных.

35. Организовать забор материала от больных и контактных для лабораторного исследования.

36. Подготовить материал на заседание комиссии по ЧС при исполнительных комитетах.

37. Обследовать "эпидзначимые" объекты с привлечением специалистов ведомств.

38. Организовать проведение дезинфекционных мероприятий в очаге инфекции.

39. Определить объем и вид помощи с вышестоящего уровня.

40. Провести сходы и собрания в населенных пунктах для разъяснения необходимости проводимых мероприятий по локализации и ликвидации гриппа птиц в личных подсобных хозяйствах.

41. Организация и проведение санитарной обработки работников оперативной бригады, дезинфекция, камерная обработка, утилизация спецодежды, дезинфекция транспорта.

Глава 7 ОРГАНИЗАЦИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ГРИППА ПТИЦ

42. Сбор, хранение и транспортировка образцов для лабораторной диагностики.

42.1. Работа с образцами, подозрительными на содержание вируса гриппа A (H5N1), а также с инфицированными клеточными культурами и эмбрионами должна проводиться в соответствии с требованиями санитарных правил СН 1.2.011-94 "Безопасность работы с микроорганизмами I, II групп патогенности".

42.2. Для диагностики заболевания могут быть использованы следующие образцы:

- аспират из носоглотки;

- мазок из носа;

- мазок из носоглотки;

- смыв из носовой полости;

- сыворотка, взятая в острой фазе инфекции и стадии реконвалесценции (парные сыворотки).

По клиническим показаниям к ним могут быть добавлены:

- трахеальный аспират;

- бронхоальвеолярный лаваж;

- биоптат легочной ткани;

- ткань легкого или трахеи, взятая post mortem.

Оптимальным сроком забора клинического материала, предназначенного для выявления вируса гриппа A (H5N1), являются первые 3 дня после появления симптомов заболевания. Техника забора клинического материала подробно описана в постановлении N 48 "О мероприятиях по профилактике гриппа и других респираторных вирусных инфекций" от 1 ноября 2000 г.

Образцы для прямого выявления антигенов иммунофлуоресцентным методом и для выделения вирусов должны доставляться на холоду (+4 град. C) и быть обработаны в течение ближайших 1 - 72 часов. Если образец не может быть обработан в течение 1 - 72 часов, он должен храниться в замороженном состоянии при температуре от -70 град. C и ниже. Необходимо не допускать повторного замораживания и оттаивания при транспортировке во избежание потери инфекционности. Сыворотка может храниться при +4 град. C примерно неделю, для более длительного хранения она должна быть заморожена при -20 град. C.

Образцы из дыхательных путей должны собираться и доставляться в средах для транспортировки вирусов.

42.3. Среда для транспортировки вируса: в 1 литр раствора Хэнкса, содержащего 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА), добавить:

                               6
     - бензилпенициллин (2 x 10  МЕ/л)
     - стрептомицин (200 мг/л)

                           6
     - полимиксин Б (2 х 10  МЕ/л)
     - гентамицин (250 мг/л)

                         6
     - нистатин (0,5 х 10  МЕ/л)
     - офлоксацина гидрохлорид (60 мг/л)
     - сульфометаксозол (0,2 г/л).

42.4. Образцы вирусов гриппа не должны храниться или перевозиться в сухом льду (твердом диоксиде углерода), если они не запаяны в стекло или запечатаны, закрыты и запаяны в двойную пластиковую упаковку. Такая упаковка образца объясняется тем, что углекислый газ способен быстро инактивировать вирусы гриппа, если он проникает в образец в результате сжатия пробок при замораживании.

42.5. Транспортировка образцов должна осуществляться в соответствии с Руководством N 11-7-13-2002 от 30.12.2002 года "Порядок учета, хранения, передачи и транспортировки микроорганизмов I - IV групп патогенности".

Все транспортируемые образцы должны быть упакованы в тройную упаковку, содержащую три упаковочных слоя. Упаковка должна выдерживать удары и нагрузки, имеющие место при транспортировке. Упаковка должна быть выполнена с учетом предотвращения любой утечки содержимого. Первичная емкость должна быть помещена во вторичную упаковку таким образом, чтобы она не могла сломаться при нормальных условиях транспортировки, разбиться или протечь во вторичную упаковку. Вторичная упаковка должна быть помещена в последнюю внешнюю упаковку с подходящим мягким материалом. Любая протечка содержимого не должна существенно вредить защитным свойствам этого материала или самой внешней упаковки.

Первичные емкости должны быть защищены от утечки, и их объем не должен превышать 500 мл. Между первичной емкостью и вторичной упаковкой должен находиться абсорбирующий материал; если несколько первичных емкостей помещаются во вторичную упаковку, каждая из них должна быть отдельно завернута или отделена таким образом, чтобы исключить контакт между ними. Абсорбирующего материала должно быть достаточно, чтобы полностью впитать все содержимое первичных емкостей, а вторичная упаковка должна быть защищена от протечек. Первичная емкость или вторичная упаковка должны выдерживать внутреннее давление при разнице давления не менее 95 КПа (0,05 бар). Внешняя упаковка должна содержать не более 4 литров.

При транспортировке твердых тел первичные емкости должны быть защищены от просыпания и содержать не более 500 г материала. Если несколько хрупких первичных емкостей помещаются в одну вторичную упаковку, каждая из них должна быть отдельно завернута или отделена таким образом, чтобы исключить контакт между ними, а вторичная упаковка должна быть защищена от протечек. Внешняя упаковка должна иметь вес не более 4 кг.

Для авиатранспортировки внешний размер готовой упаковки должен быть не менее 10 см.

Упаковка должна соответствовать определенным имеющимся стандартам.

Для получения дальнейшей информации об определениях, требованиях к упаковке, маркам и ярлыкам, сопроводительных документах, текущих инструкциях по перевозке обращаться к коммерческим поставщикам упаковок или доступным курьерским компаниям.

43. Лабораторные тесты для выявления вируса гриппа птиц А (H5N1) в образцах от пациентов с гриппоподобными заболеваниями.

43.1. При диагностике гриппа A (H5N1) используют следующие методы:

- иммунофлуоресцентный анализ, результаты могут быть получены через 60 - 120 минут;

- иммуноферментный анализ, результаты могут быть получены через 3 - 4 часа;

- полимеразная цепная реакция, результаты могут быть получены через 24 часа.

Выделение вируса в культуре клеток или куриных эмбрионах. Результаты могут быть получены через 2 - 10 дней. Идентификация вируса производится с помощью РТГА.

43.2. Иммунофлуоресцентный анализ (ИФА) позволяет выявить вирус как в клинических образцах, так и в культурах клеток. Клинические образцы, полученные как можно быстрее после появления клинических симптомов, являются предпочтительными, поскольку число инфицированных клеток уменьшается по ходу болезни. Выполнение ИФА на инфицированных культурах клеток предпочтительно, т.к. позволяет амплифицировать любой имеющийся вирус.

Тест проводится в соответствии с общепринятыми для ИФА инструкциями: эпителиальные клетки отмываются от загрязнений слизью центрифугированием, фиксируются и метятся специфическими моноклональными антителами. Инфицированные клетки респираторного эпителия в клинических образцах очень неустойчивы и легко повреждаются. Поэтому они должны храниться в холоде на льду по ходу обработки и не должны центрифугироваться более чем при 500 об/мин.

Для обеспечения соответствующего контроля моноклональных антител и конъюгата, а также для облегчения интерпретации специфического свечения в опыт должны быть включены неинфицированные клетки, а также контрольные образцы с гриппом А/Н3, А/Н1 и, по возможности, клетки, инфицированные А/Н5.

Специфическое свечение должно быть интенсивным, внутриклеточным, ярко-зеленым. Может наблюдаться ядерное и / или цитоплазматическое свечение. Положительным считается обнаружение одной или более клеток со специфическим внутриклеточным свечением.

43.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - современный метод идентификации генома вирусов гриппа.

Интерпретация результатов: ожидаемый размер продуктов ПЦР на грипп A (H5N1): на Н5 - 358 bp и 615 bp - на N1. Если тест проводится без положительного контроля, продукты должны быть секвенированы и сравнены с последовательностями имеющихся баз данных. Отсутствие продуктов ПЦР (т.е. отрицательный результат) не исключает присутствия вируса гриппа A (H5N1). Результаты должны быть интерпретированы в совокупности с доступной клинической и эпидемиологической информацией. Для исключения вируса гриппа A (H5N1) образцы от пациентов с высокой вероятностью гриппа A (H5N1) должны быть тестированы с помощью других методов (ИФА, выделение вируса или серология).

43.4. Серологические тесты, определяющие наличие специфических антител к вирусу гриппа A (H5N1), включают РТГА, иммуноферментный анализ и тест нейтрализации вируса (микронейтрализации). Поскольку тест микронейтрализации требует использования живых вирусов, его применение для выявления специфических антител к A (H5N1) ограничено лабораториями с возможностями биологической защиты второго уровня. Сыворотка определяется как положительная, если специфический титр второй сыворотки в РТГА выше в 4 раза и более при сравнении с титром, полученным с первой сывороткой.

Постановка иммуноферментных тестов осуществляется в соответствии с прилагаемыми к тест-наборам инструкциями.

43.5. Выделение вируса в куриных эмбрионах и культуре клеток.

Эти методы позволяют, помимо идентификации возбудителя, проводить дальнейшее изучение антигенных, фенотипических и генетических свойств возбудителя, а также определять его чувствительность к лекарственным препаратам. Выделение вируса на куриных эмбрионах проводится согласно методике, описанной в постановлении N 48 от 01.11.2000 г.

В последние годы было отмечено изменение биологических свойств некоторых штаммов вирусов гриппа и, в связи с этим, более эффективное их выделение в культуре клеток МДСК по сравнению с эмбрионами кур. Использование метода выделения вирусов гриппа в культуре клеток повышает вероятность быстрого выделения и идентификации нового штамма, что приобретает особую значимость в предпандемический период. В методику выделения вируса гриппа в культуре клеток внесен ряд изменений по сравнению с постановлением N 48 от 01.11.2000 г.

Для выделения вирусов гриппа, в том числе вирусов гриппа птиц, используют культуры клеток МДСК и VERO. Клетки МДСК являются оптимальной клеточной системой. При использовании культуры клеток необходимо помнить, что культура МДСК сохраняет высокую чувствительность к вирусам гриппа А и В на протяжении 60 - 80 пассажей. Во избежание "старения" культуры и снижения ее чувствительности к вирусу гриппа субкультивирование проводят каждые 4 - 7 дней.

Материалом для выделения вирусов служит отделяемое из глубоких отделов носовой полости, зева, а также секционные ткани легкого и бронхов. Для успешного выделения вирусов оптимальным является незамедлительное заражение клеточной культуры, поскольку при хранении материала инфекционная активность вирусов падает. При отсутствии монослойной культуры на момент поступления клинических образцов последние могут храниться в лаборатории до заражения при +4 град. C не более 2 дней. Для более длительного хранения они должны быть заморожены при температуре не выше -70 град. C. Для сохранения инфекционности вируса следует избегать повторного замораживания - оттаивания образца.

43.5.1. Материалы и оборудование.

1) Транспортная среда для доставки клинических образцов: раствор Хэнкса, содержащий 0,5-процентного раствора 5-й фракции бычьего сывороточного альбумина (для стабилизации вируса) и гентамицин 10 мг/мл.

2) Среда для культивирования клеток (среда роста): ДМЕМ (Сигма, кат. N Д1152), содержащая 7% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота (СЭКРС) (Сигма, кат. N F7524), и антибиотики: пенициллин / стрептомицин 100 ЕД/мл, гентамицин 10 мг/мл. Во флакон с пенициллином (1 млн.ед.) добавляют 10 мл среды ДМЕМ (без сыворотки), после растворения содержимое флакона переносят во флакон со стрептомицином (1 г). Смесь пипетируют до полного растворения, фасуют по 0,5 мл и хранят при температуре -20 град. C. На флакон среды (450 мл) добавляют 0,5 мл смеси пенициллин/стрептомицин (конечная концентрация 100 ед/мкг/мл).

3) Среда для выделения вируса: ДМЕМ (Сигма, кат. N Д1152), содержащая Трипсин - ТРСК (тип X111 из поджелудочной железы быка, Сигма, кат. N Т-Т1426) в конечной концентрации 2 мкг/мл.

4) Раствор для снятия клеток: Трипсин - ЭДТА (Сигма, кат. N Т4049) или (0,05-процентный трипсин, 0,53 мМ ЕДТА х 4 Na).

5) Культура клеток МДСК линии CCL 34.

6) Материалы и оборудование для постановки реакции ГА и РТГА:

- планшеты для иммунологических реакций;

- дозатор 8-канальный, рабочий объем 2 - 200 мкл;

- дозатор 1-канальный, рабочий объем 2 - 200 мкл;

- взвесь эритроцитов человека 0 (1) группы крови 0,75-процентная или 1-процентная взвесь куриных эритроцитов;

- физиологический раствор;

- сыворотка диагностическая гриппозная.

7) Оборудование:

- холодильник бытовой (4 +/- 1) град. C;

- рефрижератор (-70 +/- 1) град. C;

- центрифуга лабораторная (до 6000 об/мин);

- термостат (37 +/- 1) град. C;

- микроскоп биологический МБИ-3 или инвертированный;

- пенициллиновые флаконы;

- флаконы культуральные 25 кв.см (кат. N 83.1810 каталог фирмы SARSTEDT);

- пробки резиновые N 14 - 14,5;

- стерильные пипетки на 1,5 и 10 мл;

- покровные стекла.

43.5.2. Подготовка клинического образца к исследованиям.

Мазки из носа, глотки и комбинированные назофарингеальные мазки, взятые в первые три дня от момента появления симптомов заболевания, помещают во флакон с 2 мл транспортной среды и в течение 4 - 5 часов доставляют в лабораторию. Транспортировка пробы осуществляется при +4 град. C.

Перед заражением необходимо обработать клинический образец ультразвуком (30 сек при 12 Кгц) или дважды провести процедуру замораживания-оттаивания с целью обогащения проб внутриклеточным антигеном. Энергично встряхнуть флакон и отжать тампон о стенки флакона. Затем удалить тампон и добавить к пробе 0,2 мл гентамицина (10 мг/мл), оставить при комнатной температуре на 10 минут, центрифугировать флакон при 1000 об/мин 5 минут. Для заражения культуры клеток используют надосадочную жидкость. Оставленный для последующих исследований материал хранят при -70 град. C.

43.5.3. Описание метода.

Необходимое количество сред и растворов готовят непосредственно перед употреблением в зависимости от количества исследуемых образцов. Все растворы перед использованием должны быть подогреты до температуры 35 - 37 град. C.

43.5.4. Посев клеток на пенфлаконы, пробирки, матрасы.

Культуральный флакон Т-25 с клеточным монослоем дважды промыть теплой средой ДМЕМ. Затем:

- удалить среду и добавить 1,0 мл раствора трипсин-ЭДТА;

- распределить трипсин равномерно по поверхности монослоя, осторожно покачивая, и выдержать 1 минуту, после чего слить трипсин и матрас поместить в термостат на 1 - 3 минуты, постоянно контролируя состояние монослоя (флакон можно потряхивать для облегчения сползания клеток);

- добавить 1 мл СЭКРС для инактивации оставшегося трипсина;

- добавить 9 мл среды ДМЕМ, осторожно распипетировать клетки и провести подсчет клеток в камере Горяева. При хорошем состоянии культуры и полном снятии клеток с одного матраса снимают приблизительно 7 миллионов клеток (около 700000 кл/мл). Полученную суспензию делят на две части по 5 мл. Одну часть используют для последующего субкультивирования клеток, а вторую часть клеток используют для выделения вируса. В зависимости от поставленных задач и необходимости иметь монослой клеток рекомендуется подготовить следующие концентрации клеток, разведя 5 мл клеточной суспензии в соответствующее число раз средой роста: 100000 клеток/мл - 72 часа инкубации; 200000 клеток/мл - 48 часов инкубации; 400000 клеток/мл - 24 часа инкубации.

Для субкультивирования добавить по 6 мл клеточной суспензии на соответствующее число флаконов Т-25.

Для выделения вирусов в пенфлаконы в зависимости от желаемого времени формирования монослоя добавить по 2,0 мл среды, содержащей соответствующую концентрацию клеток.

Клетки поместить в термостат и инкубировать при 37 град. C необходимое время.

43.5.5. Выделение вируса.

Для выделения вируса необходимо оценить состояние монослоя, который должен быть сливным. В каждом эксперименте предусматривают два контрольных флакона: со сменой и без смены среды.

ВНИМАНИЕ! Все последующие работы с вирусом гриппа АН5 проводятся в ламинарных боксах 2-го класса безопасности.

Из всех флаконов аккуратно отсасывают среду роста, кроме контроля без смены среды, и дважды отмывают (по 2 мл) теплым раствором среды ДМЕМ (без сыворотки!). Во флаконы вносят по 0,2 мл образца (на одну пробу используют два флакона). В контрольный флакон со сменой среды добавляют 0,2 мл среды ДМЕМ.

В течение 1 часа при 37 град. C проводят адсорбцию.

Затем во флаконы добавляют по 1 мл теплой ДМЕМ (без сыворотки), содержащей ТРСК-трипсин в конечной концентрации 2 мкг/мл.

Флаконы инкубируют при 37 град. C, желательно в термостате с подачей 5-процентного СО2, вплоть до 7 суток, ежедневно контролируя состояние монослоя на наличие вирусспецифического ЦПД.

Через каждые 2 - 3 дня, начиная с 48 часов после заражения, размножение вируса контролируют в реакции гемагглютинации. С этой целью из каждого флакона отбирают по 50 мкл культуральной жидкости. Пробы от одного больного объединяют, и в реакции гемагглютинации определяют титр размножившегося вируса. Реакция ставится микрометодом с 0,75-процентной взвесью эритроцитов человека 0 (1) группы крови или с 1-процентной взвесью эритроцитов кур.

При появлении выраженного ЦПД и / или гемагглютинирующей активности, культуральную среду собирают и используют для последующего типирования вируса в РТГА в присутствии специфических диагностических сывороток.

При отрицательном результате клетки разрушают двукратным замораживанием - оттаиванием, объединяют клеточный лизат от одного больного и производят следующий пассаж, контролируя репродукцию вируса по ЦПД и ГА. Если после трех пассажей гемагглютинирующая активность не определяется, то проба считается отрицательной.

Все вирусы гриппа и нетипируемые гемагглютинирующие агенты для последующего изучения их антигенной принадлежности необходимо пересылать в холодовом режиме в НЦГ (Минск, ул. К.Цеткин, 4, комната 45), известив получателя по телефону 206 52 66 или по e-mail nvg@briem.ac.by. О подозрении в принадлежности изолята к субтипу А/Н5 необходимо указать в сопроводительных документах и при извещении.

Внимание!

Золотое правило N 1 - никогда не работайте одновременно с клиническими образцами для выделения вирусов и с лабораторно адаптированными штаммами.

Золотое правило N 2 - никогда не работайте с клиническими образцами человека, свиньи и птиц в одной и той же лаборатории. Никогда не храните изоляты при -20 град. C. Для хранения изолятов используйте морозильную камеру с температурой -70 град. C.

43.6. Лаборатории, у которых нет возможности проводить специфическую идентификацию вируса гриппа A (H5N1), должны передать образцы в Государственное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии" для дальнейшей идентификации и характеристики (тел. 2065266).

Архів документів Папярэдні | Наступны