ПОИСК ДОКУМЕНТОВ

Приказ Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 21.03.2006 № 200 "О профилактике заболеваний людей лептоспирозом"

Текст документа с изменениями и дополнениями по состоянию на ноябрь 2013 года

< Главная страница

Территория Республики Беларусь по своим природно-климатическим и почвенно-географическим условиям благоприятна для существования природных и антропургических очагов лептоспироза.

Заболевания лептоспирозом людей на территории республики регистрируются с 1947 года. Наиболее выраженное неблагополучие отмечалось в шестидесятых годах. В последнее десятилетие заболеваемость носит спорадический характер. Ежегодно выявляется от 20 до 45 случаев заболеваний, главным образом в Могилевской и Гомельской областях.

В общей структуре заболеваемости лептоспирозом преобладает иктерогеморрагический лептоспироз (36% за 2004 - 2005 годы), основным природным резервуаром которого является серая крыса.

Болеют преимущественно люди, имевшие контакт с мышевидными грызунами в местах постоянного проживания или временного пребывания, а также лица повышенного риска инфицирования (работники мясокомбинатов, птицефабрик, молочно-товарных ферм и другие).

Учитывая наличие на территории республики большого числа природных очагов, возможность формирования стойких антропургических очагов, существует постоянная угроза заражения людей возбудителями лептоспироза.

С целью профилактики заболеваний людей лептоспирозом и повышения эффективности проводимых мероприятий по борьбе с распространением этой инфекции ПРИКАЗЫВАЮ:

1. Утвердить прилагаемую Инструкцию "Клиника, лечение, лабораторная диагностика и профилактика лептоспироза".

2. Начальникам управлений здравоохранения (охраны здоровья) облгорисполкомов, председателю Комитета по здравоохранению Мингорисполкома и главным государственным санитарным врачам областей и г.Минска:

обеспечить проведение диагностических, лечебных, профилактических и противоэпидемических мероприятий в отношении лептоспирозной инфекции;

регулярно проводить (не реже 1 раза в 2 года) областные семинары для медицинских работников (врачей и среднего медицинского персонала) лечебно-профилактических и санитарно-эпидемиологических организаций по вопросам клиники, эпидемиологии и профилактики лептоспироза;

активизировать санитарно-просветительную, разъяснительную работу среди населения; шире использовать средства массовой информации (радио, телевидение, печатные издания).

3. Главным государственным санитарным врачам областей и г.Минска:

обеспечить проведение мониторинга за циркуляцией возбудителей лептоспироза в объектах внешней среды и среди векторных видов животных с целью своевременного обнаружения новых и выявления признаков активизации существующих природных и антропургических очагов инфекции;

усилить контроль за соблюдением требований санитарных правил на животноводческих фермах, мясокомбинатах и других объектах высокого риска профессионального заражения, обратив особое внимание на обеспечение грызунонепроницаемости помещений, эффективное проведение дератизационных мероприятий, создание необходимых условий для соблюдения работающими мер личной профилактики;

осуществлять постоянную межведомственную взаимоинформацию и взаимодействие во всех случаях заболеваний лептоспирозом людей и животных.

4. Контроль и методическое руководство вопросами диагностики и лечения больных лептоспирозом возложить на главного инфекциониста Министерства здравоохранения и главных инфекционистов областных управлений здравоохранения (охраны здоровья) и Комитета по здравоохранению Мингорисполкома.

5. Контроль за выполнением настоящего приказа возложить на заместителей Министра по курации.

6. Считать утратившими силу на территории Республики Беларусь:

приказ Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 29 ноября 1993 г. N 280 "О профилактике заболеваний людей лептоспирозом";

приложения N 1 - 3 к приказу Министерства здравоохранения СССР от 13 ноября 1979 г. N 1152 "О профилактике заболеваний людей лептоспирозом":

методические указания по эпидемиологии и профилактике лептоспироза (приложение N 1);

методические указания по лабораторной диагностике лептоспироза (приложение N 2);

методические рекомендации по клинике, диагностике и лечению лептоспироза (приложение N 3).

И.о. Министра В.П.РУДЕНКО

                                                 УТВЕРЖДЕНО
                                                 Приказ
                                                 Министерства
                                                 здравоохранения
                                                 Республики Беларусь
                                                 21.03.2006 N 200

Раздел I ОБЩИЕ ТРЕБОВАНИЯ

Глава 1 ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

1. Инструкция регламентирует работу по вопросам профилактики, клиники, диагностики лептоспироза человека.

2. Настоящая Инструкция предназначена для специалистов органов и учреждений государственного санитарного надзора, организаций здравоохранения, осуществляющих организацию противоэпидемических мероприятий по борьбе с лептоспирозом.

Глава 2 ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

3. Лептоспироз - острая природно-очаговая зоонозная инфекционная болезнь диких, домашних животных и человека, широко распространенная в различных ландшафтно-географических зонах мира.

Источником лептоспирозной инфекции для человека являются дикие, домашние и промысловые животные.

Основной путь передачи инфекции - водный, меньшее значение имеют контактный и пищевой. Человек от человека не заражается. В организм человека и животных возбудитель проникает через поврежденные кожу и слизистые оболочки полости рта, желудочно-кишечного тракта, глаз, носа, наружных половых органов.

Основным резервуаром и источником лептоспироза являются грызуны, больные и переболевшие животные - лептоспироносители.

Наиболее благоприятная среда для сохранения лептоспир вне организма - вода открытых водоемов, невысыхающие лужи, пруды, болота, медленно текущие речки, влажная почва с реакцией, близкой к нейтральной.

4. Эпидемическая обстановка по лептоспирозу продолжает оставаться неблагополучной, что обусловлено наличием во всех областях Республики Беларусь природных и хозяйственных очагов, а также формированием новых стойких очагов инфекции как в сельской местности, так и в городах. В республике ежегодно регистрируется в среднем от 20 до 45 заболеваний. На фоне спорадических случаев регистрируются групповые заболевания, связанные с употреблением инфицированной лептоспирами питьевой воды.

В последнее десятилетие широкое распространение получил лептоспироз, вызываемый возбудителями серогруппы Icterohaemorragiae (основной резервуар - серая крыса). В общей структуре заболеваемости лептоспирозом остается высоким удельный вес заболеваний людей, вызванных возбудителями серогруппы Grippotyphosa (основной резервуар - полевая мышь), Canicola (основной резервуар - собаки) и Hebdomadis (основной резервуар - крупный рогатый скот).

На территории Беларуси возбудителями лептоспирозов сельскохозяйственных животных и собак являются лептоспиры серогрупп Pomona, Tarassovi, Grippotyphosa, Sejroe, Icterohaemorrhagiae, Canicola.

В природных очагах установлена циркуляция лептоспир серогрупп Icterohaemorrhagiae, Grippotyphosa, Pomona, Sejroe, Australis.

В этиологической структуре лептоспирозов человека преобладают возбудители серогрупп Icterohaemorrhagiae, Grippotyphosa, Canicola, Pomona и Sejroe.

Возросла вероятность завозных случаев лептоспирозов, вызванных возбудителями "экзотических" сероваров (например, pyrogenes, djasiman, hebdomadis и других), циркуляция которых на территории Беларуси не установлена.

Глава 3 КЛИНИКА И ЛЕЧЕНИЕ ЛЕПТОСПИРОЗА

5. Патогенез.

Первая фаза. Входными воротами инфекции являются поврежденная кожа и слизистые оболочки. Патогенные лептоспиры, благодаря активной подвижности, преодолевают эти защитные барьеры организма человека, не оставляя каких-либо изменений воспалительного характера на месте внедрения. Лептоспиры быстро проникают в кровь, при этом регионарные лимфоузлы не играют роли фиксирующего фактора. Данная фаза болезни характеризуется внедрением возбудителя, кратковременной бессимптомной лептоспиремией и первичной диссеминацией лептоспир в организме, их проникновением в основном в почки, печень, легкие, селезенку, через гематоэнцефалический барьер.

Клинически эти патогенетические изменения в организме больного человека соответствуют инкубационному периоду. Длительность первой фазы патогенеза - 7 - 20 дней.

Вторая фаза патогенеза включает вторичную лептоспиремию, появление в крови токсинов, а также вторичную диссеминацию лептоспир в организме. Длительность второй фазы 3 - 7 дней, клинически она соответствует начальному периоду заболевания и проявляется выраженным синдромом интоксикации.

Третья фаза патогенеза - наивысшая степень токсемии. Продуктами распада и метаболизма лептоспир поражаются внутренние органы (особенно почки, печень), центральная нервная система, развиваются генерализованный капилляротоксикоз, ДВС-синдром, кровоизлияния в органы и кровотечения. В результате действия токсинов на периферические сосуды и миокард, возникновения гиповолемии, связанной с лихорадкой и кровотечениями, возможно развитие шока. Гемодинамические нарушения и действие токсинов лептоспир ведут к поражению почек, которое рассматривается как интерстициальный нефрит с некрозом клубочковых эпителиальных клеток и основной мембраны с последующим вовлечением в процесс почечных канальцев. В тяжелых случаях развивается острая почечная недостаточность (ОПН).

Дегенеративные и частично некротические изменения гепатоцитов, холестаз, гемолиз эритроцитов приводят к появлению желтухи. Повреждение стенок капилляров печеночных балок приводит к серозному отеку печеночной ткани, а в более тяжелых случаях и к кровоизлиянию в паренхиму органа. Таким образом, механизм возникновения желтухи при лептоспирозах носит двоякий характер. С одной стороны, развивающаяся желтуха обусловлена проявлениями паренхиматозного гепатита, с другой стороны, ее возникновение обусловлено также усиленным распадом эритроцитов (гемолиз).

В тяжелых случаях развивается сочетанная острая печеночно-почечная недостаточность (ОППН). Наряду с инфекционно-токсическим шоком (ИТШ) она становится основной причиной смерти при лептоспирозе. Неблагоприятные исходы могут быть связаны с развитием респираторного дистресс-синдрома (РДС), пневмонии, менингита, полиорганной недостаточности. Клинически 3-я фаза патогенеза соответствует периоду разгара заболевания - концу 1-й - 3-й недели болезни.

Четвертая фаза - нестерильная стадия иммунитета. Количество специфических антител в крови нарастает, но лептоспиры еще сохраняются в органах, чаще в почках. По времени эта фаза соответствует 3-й - 4-й неделе болезни. В этот период возможны рецидивы заболевания, осложнения со стороны глаз, сердца, почек, нервной системы.

Пятая фаза патогенеза: формирование стерильного специфического иммунитета соответствует 5-й - 6-й неделе от начала болезни - периоду реконвалесценции. Исследование специфических ЦИК обнаружило лептоспирозную антигенемию у реконвалесцентов при выписке из стационара и через 3 месяца. Это свидетельствует о незавершенности инфекционного процесса к моменту клинического выздоровления и объясняет иммуновоспалительные отдаленные осложнения лептоспироза через 3 - 6 месяцев после перенесенного заболевания.

6. Патологическая анатомия.

Патологическая анатомия наиболее детально изучена при тяжелом течении заболевания, протекающего, как правило, с геморрагическим синдромом, поражением печени и почек (иктерогеморрагический лептоспироз).

Характерны изменения в эндотелии капилляров различных систем органов и тканей, вследствие чего стенки становятся хрупкими, повышена их проницаемость, что сопровождается множественными кровоизлияниями различных размеров и локализацией в почках, печени, селезенке, надпочечниках, легких, эндокарде и перикарде, брюшине, коже, видимых слизистых, подкожной клетчатке, лимфатических узлах.

Печень увеличена в объеме, плотная на ощупь, с гладкой поверхностью. При гистологическом исследовании выявляются дистрофические изменения в различной степени выраженности печеночных клеток и наряду с ними явления регенерации ткани. При выраженной желтухе обнаруживаются желчные тромбы в центральной зоне долек. Следует отметить, что поражение печени при лептоспирозе не достигает той степени, которая отмечается при вирусном гепатите, здесь цитолиз гепатоцитов минимальный, что говорит в пользу больше холестатического гепатита.

Наибольшие изменения обнаруживаются в почках. Их можно охарактеризовать как нефрозонефрит. Почки увеличены, на разрезе выявляются кровоизлияния под капсулой и в ткани органа. Изменения в клубочках незначительны, в канальцах же, как правило, выражены явления дегенерации, некроза и десквамации почечного эпителия и мутного набухания клеток последнего. В надпочечниках и околопочечной жировой клетчатке - кровоизлияния мелкоточечного характера.

Отмечается увеличение селезенки, консистенция и поверхность ее обычная, соскоба нет. При микроскопическом исследовании - кровоизлияния в пульпу, гиалиноз центральных артерий. Явления ретикуло-эндотелиальной гиперплазии лимфоидных элементов.

Лимфатические узлы как наружные, так и внутренние системно гиперплазированы, капсула их напряжена, при гистологическом исследовании находят кровоизлияния.

Серозный менингит с отеком мягких мозговых оболочек, периваскулярными лимфоидными инфильтратами является характерным морфологическим признаком лептоспироза. Ткань головного мозга в части случаев отечна, с очагами неравномерного кровенаполнения. Встречаются дегенеративные изменения в веществе мозга.

В мышце сердца развиваются дистрофия и ожирение, межуточный миокардит. В легких и бронхах воспалительные и дистрофические нарушения, различной величины кровоизлияния в виде крыльев бабочки, явления мелкоочаговой пневмонии.

В поперечно-полосатых мышцах опорно-двигательного аппарата обнаруживаются различной величины кровоизлияния, неравномерное набухание волокон, дегенеративные изменения в синапсах мышечного волокна и нерва.

7. Клинические особенности лептоспироза.

По международной статистической классификации болезней заболевания лептоспирозной этиологии группируются в соответствии с этиологическим принципом следующим образом: A.27.0 - лептоспироз желтушно-геморрагический, вызванный L.Icterohaemorrhagiae; A.27.8 - другие формы; A.27.9 - неуточненный лептоспироз.

Клинико-патогенетическая классификация лептоспироза включает 3 формы заболевания по степени тяжести: легкую, средней тяжести и тяжелую; 2 основные формы течения: желтушную и безжелтушную с выделением ведущих синдромов - ренального, гепаторенального, менингеального, геморрагического; течение болезни без рецидивов и с рецидивами, без осложнений и с осложнениями. Более подробно клинико-патогенетическая классификация лептоспирозов представлена в таблице 1.

Течение лептоспироза цикличное. Выделяют 4 периода: инкубационный, начальный, фаза разгара, реконвалесценции.

Длительность инкубационного периода составляет от 2 до 30 дней, чаще 7 - 14 дней.

Начальный период лептоспироза продолжается 3 - 7 дней. Заболевание в 95 - 98% случаев начинается остро с озноба и резкого повышения температуры до 39 - 40 град. C. Больные часто называют не только день, но и час заболевания. В начальный период болезни независимо от серогруппы лептоспир в 50 - 100% случаев встречаются повышение температуры до 39 - 40 град. C в 1-й - 2-й день болезни, головная боль, озноб, мышечные и суставные боли, общая слабость, тошнота, инъекция сосудов склер, тахикардия.

Лихорадка постоянная или ремитирующая, продолжается от 3 до 12 дней. Температура снижается критически или ускоренным лизисом. После периода апирексии длительностью от 1 до 14 дней возможны 1 - 5 повторных лихорадочных волн. Нормализация температуры при лептоспирозе не всегда является благоприятным симптомом. При тяжелом течении заболевания снижение температуры, как правило, к 4-му - 5-му дню совпадает со значительным ухудшением состояния, связанным с появлением органной патологии. При тяжелом течении лептоспироза также может наблюдаться длительный субфебрилитет.

Мышечные боли являются одним из наиболее характерных симптомов начального периода лептоспироза и наблюдаются в 65 - 73% случаев. Миалгии возникают в покое, усиливаются при пальпации мышц и при движении, могут сохраняться до 10-го дня болезни. Наиболее выражены боли в икроножных и поясничных мышцах (ложный симптом Пастернацкого или признак Коковина), боли менее интенсивны в мышцах шеи, спины, живота. Интенсивность мышечных болей в начальный период лептоспироза соответствует тяжести заболевания. Миалгии сильнее выражены при тяжелой форме лептоспироза и геморрагическом синдроме. Массивный некроз мышц может быть причиной последующего поражения почек. В некоторых случаях миалгии могут привести к диагностическим ошибкам. Так, интенсивные боли в мышцах живота могут имитировать "острый живот".

Для начального периода лептоспироза характерны гиперемия лица и инъекции сосудов склер, эритематозная или полиморфная сыпь на коже туловища и конечностей. Сыпь может иметь кореподобный, краснухоподобный, реже скарлатиноподобный характер. Могут встречаться и уртикарные элементы. Макулезная сыпь склонна к слиянию отдельных элементов. В этих случаях образуются эритематозные поля. Эритематозная экзантема встречается наиболее часто. При развитии геморрагического синдрома преобладает геморрагическая сыпь.

Иногда в начальный период лептоспироза увеличиваются периферические лимфатические узлы. Катаральные явления почти полностью отсутствуют. Насморк и кашель в этот период болезни отмечаются только у 2,5% больных.

Такие симптомы интоксикации, как озноб, головная боль, общая слабость, тошнота, тахикардия, не зависят от тяжести состояния больных. Однако сильная головная боль в сочетании с адинамией, заторможенностью, бессонницей, рвотой свойственна тяжелой форме болезни.

Клиническая картина лептоспироза в период разгара (органных поражений) имеет значительно больший полиморфизм, что связано с особенностью патогенеза этой инфекции. В этот период болезни выявляются симптомы поражения печени, почек, легких, сердечно-сосудистой и центральной нервной систем, признаки генерализованного капилляротоксикоза и нарушений в системе гемостаза. Полиморфизм клинической картины - сочетание синдромов или преобладание одного из них - создает трудности в диагностике, оценке тяжести состояния больного и прогнозировании исхода заболевания. Наиболее наглядным симптомом поражения печени при лептоспирозе является желтуха. Во многих случаях именно желтуха позволяет врачу заподозрить лептоспироз. По этому признаку выделяют желтушную и безжелтушную клинические формы. Желтуха может наблюдаться у больных независимо от серогруппы лептоспир, вызвавших заболевание. Однако если при лептоспирозе, связанном с L. Pomona и L. Grippotyphosa, желтушные формы составляют 3 - 9%, то при лептоспирозе, вызванном L. Icterohaemorrhagia и L.Canicola, - 40 - 84%.

Желтуха в большинстве случаев появляется на 4-й - 6-й день болезни. Короткий преджелтушный период считается характерным для лептоспироза. При тяжелой форме лептоспироза желтуха может появиться уже на 2-й - 3-й день болезни. Выраженность желтухи варьируется в широких пределах. В одних случаях она может ограничиваться легкой окраской склер, видимых слизистых оболочек, кожи, исчезающей в течение одной недели; в других случаях яркая желтуха с шафранно-красным оттенком не исчезает несколько недель. Возможен незначительный зуд кожи. Моча больных становится темной. Полная обесцвеченность кала наблюдается редко, но гипохолия имеется у большинства больных. Интенсивность желтухи в большинстве случаев соответствует тяжести лептоспироза. Гипербилирубинемия связана с повышением уровня как связанного, так и свободного билирубина, но содержание связанного билирубина увеличивается в большей степени. Повышение уровня общего билирубина крови выше 200 мкмоль/л - неблагоприятный прогностический признак.

Поражение печени при лептоспирозе проявляется ее увеличением с 3-го - 11-го дня болезни (выступает из-под края реберной дуги на 2 - 3 см, иногда больше), а также болезненностью при пальпации. Печень увеличена у 42 - 100% больных лептоспирозом. Одновременное увеличение селезенки отмечается в 5 - 56% случаев. Поражение печени при желтушной форме лептоспироза может сопровождаться развитием острой печеночной недостаточности, что прогностически неблагоприятно, особенно в сочетании с другими осложнениями лептоспироза - ОПН и геморрагическим синдромом.

В период разгара лептоспироза поражение почек регистрируется в 50 - 100% случаев. В легких случаях болезни могут наблюдаться только отклонения в анализах мочи, в тяжелых развивается ОПН, часто уже с 3-го - 4-го дня болезни и в сочетании с ИТШ. Диурез снижается до 500 мл/сутки и менее; в моче нарастает протеинурия; в осадке мочи увеличивается количество лейкоцитов, эритроцитов, цилиндров; в крови повышается уровень азотсодержащих соединений. Поражение почек особенно выражено с 7-го - 10-го дня болезни. Олигурия может смениться анурией, протеинурия - достигнуть 30 г/л; содержание мочевины в крови - повыситься до 50 - 90 ммоль/л, креатинина - до 1432 - 1945 мкмоль/л. Может развиться уремический синдром с летальным исходом. Особенностью ОПН при лептоспирозе является отсутствие отеков и артериальной гипертензии. Характерная для олигоанурической стадии ОПН гиперкалиемия выявляется в единичных случаях, чаще бывает гипокалиемия. ОПН наблюдается чаще при желтушной форме лептоспироза, особенно вызванного L. Icterohaemorrhagiae, и может сочетаться с острой печеночной недостаточностью. При тяжелой форме лептоспироза в период разгара заболевания сочетанная ОППН становится ведущим клиническим синдромом и наиболее частой причиной летального исхода.

При благоприятном течении лептоспироза по мере выздоровления олигоанурия сменяется полиурией с гипостенурией и постепенным восстановлением концентрационной функции почек в течение 2 - 4 недель. При лептоспирозе возможен не олигурический тип ОПН без снижения диуреза и заканчивающийся, как правило, выздоровлением.

Изменения сердечно-сосудистой системы у большинства больных лептоспирозом в разгар заболевания представлены приглушением сердечных тонов, тахикардией, артериальной гипотензией. Реже наблюдаются брадикардия, экстрасистолия, мерцательная аритмия. При электрокардиографическом исследовании даже при отсутствии клинических проявлений выявляются диффузные изменения миокарда или нарушение ритма и проводимости. Миокардит отмечают у 10 - 12% больных, в основном при тяжелой форме болезни. Возможно развитие эндо- и перикардита. У 10 - 60% больных развивается инфекционно-токсический шок (ИТШ), летальность в этом случае достигает 10 - 35%.

Поражение легких при лептоспирозе в разгар болезни встречается в 3 - 62% случаев. Чаще это острый бронхит и очаговая пневмония. Могут развиться и стать причиной смерти геморрагическая пневмония или геморрагический отек легких. Тяжелая острая легочная недостаточность в большом проценте случаев развивается при ИТШ и в настоящее время расценивается как респираторный дистресс-синдром (РДС) или шоковое легкое. РДС включает резкую одышку, появление кровянистой мокроты, гипоксемию, рефрактерную к ингаляции кислорода, двусторонние инфильтративные изменения в легких, выявляемые при рентгенологическом обследовании. При иктерогеморрагическом лептоспирозе как специфические описаны мелко- и крупноочаговые пневмонии.

Поражение центральной нервной системы при лептоспирозе обусловлено специфической интоксикацией и проявляется головной болью, головокружением, бессонницей, адинамией, реже - бредом и галлюцинациями. Эти симптомы могут появляться уже в начальном периоде болезни. В период разгара у 2 - 40% больных развивается менингеальный синдром. В этих случаях чаще отмечают серозный менингит, реже - энцефалит, полирадикулит, парезы, параличи. При тяжелой форме заболевания могут развиться токсическая энцефалопатия и отек мозга. Менингеальные симптомы чаще возникают в конце 1-й - начале 2-й недели заболевания, но могут сопровождать и рецидивы болезни. С развитием менингеального синдрома состояние больных значительно ухудшается, усиливается головная боль, появляются светобоязнь, рвота. Определяются ригидность мышц затылка, положительный симптом Кернига, иногда - Брудзинского. При исследовании спинномозговой жидкости выявляется плеоцитоз в широких пределах - от 50 до 2000 кл/мкл, чаще лимфоцитарный, реже смешанный или нейтрофильный. Изменения спинномозговой жидкости у больных лептоспирозом бывают и при отсутствии менингеальной симптоматики. Прогноз при лептоспирозных менингитах, как правило, благоприятный. Ликворологические изменения в ряде случаев сохраняются дольше менингеальных симптомов. При развитии энцефалита прогноз ухудшается, может наступить летальный исход.

Геморрагический синдром в разгар болезни характерен для лептоспироза, чаще наблюдается при желтушной форме (40 - 84%). Первые признаки геморрагического синдрома в виде кровоизлияний в склеры, геморрагической сыпи, носовых кровотечений появляются на 3-й - 4-й день болезни и могут быть предвестниками более грозных геморрагических осложнений. Геморрагический синдром достигает максимума на 2-й неделе болезни. Это кровохарканье, легочное и желудочно-кишечное кровотечения, макрогематурия, кровоизлияния в местах инъекций и в органы. В тяжелых случаях заболевания ДВС-синдром может быть причиной смерти.

К редким проявлениям лептоспироза в разгар болезни относятся диарея, иногда с примесью слизи, развитие острого панкреатита, некалькулезного холецистита, паротита, иридоциклита, увеита, неврита зрительных нервов.

В летальных случаях лептоспироза смерть наступает на 5-й - 48-й день болезни. Основными причинами смерти являются ИТШ в 1-ю - 2-ю неделю болезни и ОППН в сочетании с геморрагическим синдромом во 2-ю - 3-ю неделю.

Период реконвалесценции. При благоприятном течении заболевания со 2-й (при легкой форме) - 4-й недели начинается постепенное выздоровление больных. Улучшается самочувствие, исчезают головные, мышечные боли, желтуха, геморрагические проявления, восстанавливается диурез. Длительность заболевания в большинстве случаев составляет 4 - 6 недель. Долго могут сохраняться астеновегетативный синдром, общая мышечная слабость, а при рецидивах и осложнениях выздоровление будет зависеть от их характера.

Частота рецидивов при лептоспирозе составляет 20 - 60%. Возникает второй приступ лихорадки, и вновь повторяются симптомы заболевания, но, как правило, в более легкой форме. Длительность рецидива обычно 1 - 6 дней. Рецидивов может быть несколько. В периоде реконвалесценции осложнения и остаточные явления чаще отмечаются со стороны органа зрения (увеиты, ириты, иридоциклиты, атрофия зрительного нерва, слепота) и нервной системы (моно-, полиневриты, арахноидит).

8. Дифференциальная диагностика.

При проведении дифференциальной диагностики лептоспироза прежде всего нужно иметь в виду следующие заболевания: грипп, геморрагические лихорадки, сыпной тиф, вирусные гепатиты (чаще гепатит "А"), а также брюшной тиф и паратифы, инфекционный мононуклеоз, сепсис, туляремию и холецистит.

Острое начало с высокой температурой, головной болью, разбитостью, общим недомоганием, гиперемией лица, склеритом, наблюдаемыми при лептоспирозе, могут привести к ошибочному диагнозу гриппа. Однако в отличие от лептоспироза при гриппе нет выраженных болей в икроножных мышцах, печень и селезенка не увеличиваются, менее выражены геморрагические проявления, а также симптомы почечной недостаточности. Со стороны общего анализа крови - лейкопения, нормальное СОЭ. Нужно иметь в виду, что вспышки гриппа редко наблюдаются летом и охватывают широкие территории и контингенты населения. Важен эпидемиологический анамнез. Обнаружение лептоспир в крови и моче, серологические методы исследования подтверждают диагноз лептоспироза.

Общими симптомами лептоспироза и геморрагических лихорадок являются острое начало с ознобом, высокая температура, внешний вид больного, геморрагические проявления, поражение почек. При геморрагических лихорадках геморрагическая сыпь чаще локализуется в области плеч и подмышечной области, глубина поражения почек увеличивается с падением температуры, а в моче определяется наличие цилиндров, дегенеративных клеток почечного эпителия. Кроме того, в начальный период отмечается лейкопения крови при ускоренной СОЭ. Геморрагические лихорадки и лептоспироз имеют различную сезонность (заболеваемость геморрагическими лихорадками преобладает в осенне-зимний период, а лептоспирозом - в летний период года). Положительны результаты серологического обследования на ГЛПС (обнаружение антител класса Ig M с помощью твердофазного иммуноферментного анализа).

В начальный период болезни возникает трудность разграничения лептоспироза от сыпного тифа, так как последнему также свойственно острое начало, головная боль, высокая температура, увеличение печени и селезенки, лейкоцитоз крови. Кроме того, при лептоспирозе тяжелого течения, как и при сыпном тифе, могут наблюдаться геморрагические высыпания на коже, менингеальные явления. В отличие от лептоспироза, при сыпном тифе не выражены мышечные боли, сыпь появляется одномоментно на 4-й - 5-й день болезни и носит характер преимущественно розеолезно-петехиальной с локализацией на сгибательной стороне тела, отмечается преобладание энцефалитических проявлений над менингеальными. Важное значение имеют серологические специфические методы лабораторных исследований крови - РГА и РСК с риккетсиозным антигеном.

При лептоспирозе, протекающем с желтухой, наибольшую трудность вызывает дифференциальная диагностика с вирусными гепатитами, преимущественно типа "А", учитывая частоту острого гриппоподобного начала последнего, более быстрое увеличение печени и селезенки, короткий преджелтушный период (чаще до недели) и преимущественно эпидемический характер заболеваемости.

В отличие от вирусных гепатитов, при лептоспирозе не отмечаются в преджелтушный период диспептические проявления, боли в суставах, а имеют место выраженные мышечные боли. Лихорадка у больных лептоспирозом держится длительно, и в период появления желтухи выражены геморрагические проявления, как и почечные изменения, возможны менингеальные симптомы, повышение активности ферментов сыворотки крови менее значительно. При вирусных гепатитах лихорадка отмечается в преджелтушном периоде, не характерно поражение почек, повышение активности трансаминаз резко выражено. Кроме того, отмечаются лейкопения, лимфоцитоз и нормальная или замедленная СОЭ. Показатели мочевины, креатинина, остаточного азота значительно повышены при лептоспирозе. При вирусных гепатитах подобные изменения отмечаются только при развитии выраженной печеночной недостаточности, преимущественно наблюдаемой при гепатите "В", отличить который от лептоспироза легче (длительный, преимущественно астенический или артралгический преджелтушный период при постепенном начале болезни, а также более медленное увеличение печени и селезенки, преимущественно безлихорадочное начало и течение заболевания у взрослых). Специфическая диагностика вирусных гепатитов включает маркерную диагностику: обнаружение HBs Ag, анти-HBc Ig M, анти-ВГА- Ig M, анти-ВГС- Ig M.

В части случаев возникает необходимость исключить брюшной тиф. Для брюшного тифа характерно постепенное начало болезни, отсутствуют мышечные боли, не характерны геморрагические проявления, сыпь появляется позже, чем при лептоспирозе (с 7-го - 8-го дня болезни). Сыпь розеолезная, мономорфная, не обильная и обычно локализуется на коже туловища (живота, груди) на фоне разной степени выраженности тифозного статуса (вялость, заторможенность, адинамия). Язык увеличен и обложен, но с чистыми краями. При брюшном тифе не наблюдается глубоких патологических изменений в почках, имеет место лейкопения с относительным лимфоцитозом. Положительные бактериологические и серологические исследования на брюшной тиф (гемо-, урино- и копрокультуры, реакция Видаля, РНГА) позволяют окончательно подтвердить диагноз. Значительно сложнее дифференцировать лептоспироз от паратифов А и Б, при которых также имеют место острое начало болезни, головная боль, высокая лихорадка, увеличение печени и селезенки; и тифозный статус, в отличие от брюшного тифа, не всегда четко выражен. Внешний же вид больных лептоспирозом и паратифами (гиперемия лица, инъекция сосудов склер и конъюнктив) может быть одинаковым. Сходства добавляют и высыпания на коже, а часто и сам характер высыпаний. Однако при паратифах нет четко выраженных мышечных болей, особенно в икроножных мышцах, сыпь появляется позже, на 6-й - 7-й день от начала болезни, преимущественно на груди и животе, и носит розеолезный или папулезный характер. Изменения со стороны почек при паратифах незначительны. Важное значение имеют, как и при дифференциальной диагностике с брюшным тифом, результаты бактериологических и серологических исследований.

При сепсисе различной этиологии на фоне гектической температуры, увеличения печени и селезенки отмечаются ознобы, потливость, наличие первичного гнойного (воспалительного) очага, высокого нейтрофилеза с палочкоядерным сдвигом. Все эти явления достаточно выражены, поражение почек развивается позже. Необходим учет эпидемиологических данных, свойственных лептоспирозу, а также выделение возбудителя из крови и мочи, постановка серологических реакций с выделенными штаммами.

Лептоспироз, протекающий с желтухой, часто приходится дифференцировать с воспалительными процессами желчевыводящей системы, в частности, с калькулезным холециститом, для которого характерна внезапность начала, боли в правом подреберье, тошнота, рвота, положительные симптомы Ортнера, поколачивания в области правого подреберья, быстрое развитие желтушного окрашивания кожи, потемнение мочи, обесцвечиванность кала, зуд кожи. Селезенка не увеличена, отсутствуют геморрагические проявления и менингеальные явления, нет поражения почек. В диагностике калькулезного холецистита помогают методы инструментального обследования (УЗИ органов брюшной полости).

9. Лечение лептоспироза.

Основные принципы лечения лептоспироза у больных людей можно сформулировать следующим образом.

Лечение должно проводиться в условиях только стационара, в связи с чем все больные с явным заболеванием или подозрением на него госпитализируются немедленно в обязательном порядке.

Комплексная терапия включает постельный режим, гигиенический уход, полноценное питание.

Постельный режим, особенно строгий на период первой лихорадочной волны (первые 7 - 10 дней болезни); уход за больным - гигиенический туалет полости рта, глаз, видимых слизистых оболочек и кожных покровов.

Питание должно быть полноценным, богатым белками, углеводами, жирами растительного происхождения и витаминами. Как правило, назначается диета N 13 по Певзнеру. При желтушной форме течения - диета N 5.

Этиотропная терапия.

Препараты выбора: при безжелтушной форме - амоксициллин внутрь 0,5 г каждые 8 часов, ампициллин в/м по 1,0 г каждые 6 часов или доксициклин внутрь 0,1 г каждые 12 часов; при желтушной форме - бензилпенициллин в/в, в/м 6 - 12 млн.ЕД/сутки в 4 введения или ампициллин в/в, в/м 1 г каждые 6 часов. При менингите - бензилпенициллин в/в, в/м 24 млн.ЕД/сутки.

Альтернативные препараты: тетрациклин внутрь 2 г/сутки в 4 приема или доксициклин внутрь 0,1 г каждые 12 часов. Данные препараты назначаются при отсутствии печеночно-почечной недостаточности и выраженного тромбогеморрагического синдрома.

Если этиотропная терапия начинается позже 4-го - 5-го дня от начала болезни, ее эффективность резко снижается. При необходимости проведения второго курса антибиотикотерапии чаще применяют полусинтетические пенициллины (ампициллин), цефалоспорины, левомицетин, эритромицин.

Применявшийся ранее в качестве этиотропной терапии специфический воловий лептоспирозный иммуноглобулин малоэффективен и в настоящее время не выпускается.

Патогенетическая терапия.

Патогенетическая терапия при легкой и среднетяжелой формах лептоспироза включает назначение анальгетиков, антигистаминных препаратов, поливитаминов, энтеросорбентов, умеренную инфузионную терапию. При тяжелой форме болезни в комплексе терапевтических методов особое значение приобретает интенсивная терапия, включающая дезинтоксикацию, коррекцию нарушений гомеостаза и функций жизненно важных органов. В инфузионной терапии используются глюкозо-солевые и коллоидные растворы. При ИТШ общее количество вводимой жидкости составляет 40 - 50 мл/кг в сутки, количество глюкокортикоидов в пересчете на преднизолон может достигать 2000 мг. С целью стабилизации гемодинамики и восстановления диуреза путем непрерывной внутривенной инфузии вводят допамин 5 - 15 мкг/кг·мин. При ДВС-синдроме применяют свежезамороженную плазму. После восстановления гемодинамики (ликвидация шока) консервативная патогенетическая терапия в олигоанурической стадии ОПН включает введение 5 - 10-процентного раствора глюкозы с инсулином в объеме, соответствующем физиологической потребности, раствора бикарбоната натрия, эуфиллина, трентала, леспенефрила. Глюкокортикостероиды используются в дозе от 120 до 640 мг/сутки по преднизолону. Выраженная анемия является показанием для введения эритроцитарной массы. В фазу восстановления диуреза и на полиурической стадии ОПН применяют кристаллоидные растворы. При неэффективности консервативного лечения у больных с нарастанием почечно-печеночной недостаточности применяют методы экстракорпоральной детоксикации - гемодиализ, гемофильтрацию.

10. Прогноз в целом, особенно при безжелтушном течении, благоприятный. Однако следует подчеркнуть, что при тяжелом течении лептоспироза с желтухой и выраженным гепаторенальным синдромом, геморрагическими явлениями он значительно утяжеляется, а в ряде случаев возможны летальные исходы.

11. Диспансерное наблюдение.

Лица, переболевшие лептоспирозом, в том числе и профессиональные контингенты, подлежат диспансерному наблюдению в течение 6 месяцев с обязательным клиническим обследованием окулистом, невропатологом и терапевтом, а дети - педиатром. Необходимы контрольные общие анализы крови и мочи, а перенесшим желтушную форму - биохимический анализ крови. Кратность обследования - 1 раз в два месяца. Диспансерное наблюдение переболевших лептоспирозом осуществляют кабинеты инфекционных заболеваний, а детей - участковые педиатры с привлечением узких специалистов по профилю клинических проявлений. При отсутствии КИЗов диспансерное наблюдение осуществляют участковые, цеховые терапевты.

Снятие с учета производится по истечении срока диспансерного наблюдения при полном клиническом выздоровлении (нормализация лабораторных и клинических показателей). Если по истечении 6 месяцев не происходит нормализации лабораторных и клинических данных, сроки наблюдения удлиняются до полного выздоровления.

При наличии стойких остаточных явлений больные передаются под наблюдение специалистов по профилю клинических проявлений (окулисты, терапевты, невропатологи, нефрологи).

Глава 4 ОРГАНИЗАЦИЯ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

12. Диагностические исследования на лептоспироз в регламентированном объеме проводятся лабораториями индикации возбудителей особо опасных инфекций Республиканского центра гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья (далее - РЦГЭ и ОЗ) и областных центров гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья (далее - ОЦГЭ и ОЗ).

13. Организация и выполнение диагностических исследований на лептоспироз в лабораториях должны осуществляться в соответствии с требованиями, регламентирующими:

безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности;

порядок учета, хранения, передачи и транспортировки микроорганизмов I - IV групп патогенности согласно Руководству "Порядок учета, хранения, передачи и транспортировки микроорганизмов I - IV групп патогенности" N 11-7-13-2002, утвержденному Главным государственным санитарным врачом Республики Беларусь 30 декабря 2002 г.

Порядок получения лабораториями разрешения на работу с микроорганизмами III группы патогенности определяется действующими нормативными документами о порядке выдачи разрешений на эти виды работ.

Все диагностические лаборатории, выполняющие работы с микроорганизмами III группы патогенности, должны иметь разрешение комиссии по контролю за соблюдением требований биологической безопасности и противоэпидемического режима (режимной комиссии) Министерства здравоохранения Республики Беларусь на деятельность, связанную с использованием возбудителей инфекционных заболеваний.

Раздел II ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ЛЕПТОСПИРОЗА

Глава 5 ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЗБУДИТЕЛЯ ЛЕПТОСПИРОЗА

14. Характеристика возбудителей лептоспироза

Возбудители лептоспироза людей и животных - спирохеты, относящиеся к виду Leptospira interrogans рода Leptospira, входящего в состав семейства Leptospiraceae порядка Spirochaetales. К роду Leptospira принадлежат также непатогенные лептоспиры-сапрофиты (вид Leptospira biflexa), средой обитания которых являются вода естественных или искусственных водоемов и влажная почва. Морфологически патогенные и сапрофитные формы лептоспир неотличимы, поэтому их дифференциация проводится на основе серологических, культурально-биохимических критериев и генетических маркеров.

Типичная лептоспира представляет собой спиралевидное образование, обладающее характерной прямолинейной и ротационной подвижностью. Концы у микроба изогнуты в виде крючков, которые придают ему своеобразный, легко распознаваемый вид. В культурах некоторых штаммов большинство или все клетки имеют прямые концы (бескрючковые лептоспиры). Длина лептоспиры в среднем составляет 6 - 20 мкм, а поперечник равен 0,1 - 0,16 мкм. В зависимости от длины число завитков спирали достигает 20. При продолжительном культивировании in vitro отдельные клетки могут превышать среднюю длину в 2 - 3 раза. Напротив, в патологическом материале клетки лептоспир значительно короче, чем в культуре.

В жидких средах лептоспиры вращаются вдоль длинной оси и совершают возвратно-поступательные движения без полярной дифференциации. Делящиеся клетки часто энергично и резко изгибаются в точке намечающегося деления. В полужидких средах также наблюдаются изгибание, буравящая и змеевидная подвижность.

15. Лептоспиры относятся к медленнорастущим аэробным микроорганизмам и культивируются в средах, содержащих сыворотку, сывороточный альбумин или жирные кислоты с длинной цепью (14 или более атомов углерода). Эти вещества служат основным источником углерода и энергии, а также клеточных липидов. Лептоспиры могут утилизировать неорганические соли аммония (но не аминокислоты) как главный источник азота, а также пуриновые, но не пиримидиновые основания. Для их роста также необходимы тиамин (витамин B1) и цианокобаламин (витамин B12).

Как свежевыделенные, так и музейные штаммы лептоспир чувствительны к тетрациклину, пенициллину и стрептомицину.

Оптимальный рост лептоспир наблюдается при pH 7,2 - 7,6 (диапазон роста от 6,8 до 7,8), температурный оптимум 28 - 30 град. C.

Период инкубации для достижения оптимального роста обычно составляет 6 - 14 дней, но может варьироваться от нескольких дней до 4 недель и более.

Лептоспиры способны проходить через мембранные фильтры со средним диаметром пор 0,22 мкм, что используется для очистки контаминированных культур от посторонней микрофлоры.

При кипячении лептоспиры погибают моментально, а при нагревании до 56 - 58 град. С - в течение 25 - 30 мин. Они также быстро погибают при высушивании и под воздействием прямого солнечного света. К низким температурам лептоспиры весьма устойчивы и остаются жизнеспособными после длительного замораживания. Растворы 0,1-процентный соляной кислоты, 0,5-процентный фенола инактивируют лептоспиры в течение 20 мин, активный хлор в дозе 0,3 - 0,8 мг/л - после двухчасовой экспозиции.

Для обеззараживания чистых культур лептоспир рекомендуется использовать 2-процентный раствор соляной кислоты с экспозицией 24 часа, а патологического материала - 5-процентный раствор фенола с экспозицией 2 часа.

16. Лептоспиры - типичные гидрофилы. Важными условиями для их выживания во внешней среде являются повышенная влажность и pH в пределах 7,0 - 7,4. В воде открытых водоемов патогенные лептоспиры сохраняют жизнеспособность от 7 до 30 и более дней, а во влажной почве - до 270 дней. На пищевых продуктах - от нескольких часов до нескольких дней.

Патогенные лептоспиры отличает выраженное внутривидовое разнообразие по антигенным свойствам. Основной таксон - серовар. К настоящему моменту в мире идентифицировано более 230 сероваров патогенных лептоспир, объединенных на основании антигенного родства в 23 серологические группы. В соответствии с новой концепцией определения вида у бактерий на основании результатов ДНК-ДНК гибридизации среди лептоспир выделены семь геномовидов.

Типовой штамм: Leptospira interrogans, серовар icterohaemorrhagiae, штамм RGA.

Сапрофитные лептоспиры характеризуются еще более выраженным антигенным и генетическим разнообразием, чем патогенные. Типовой штамм Leptospira biflexa: серовар patoc, штамм Patoc I.

Глава 6 МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЛЕПТОСПИРОЗА

17. Лабораторная диагностика лептоспироза основана на комплексе микробиологических и иммунологических методов, которые используются в различных комбинациях в зависимости от фазы заболевания и диагностических возможностей лаборатории.

Материалом для исследования являются кровь, моча, спинномозговая жидкость (далее - СМЖ) больного, а при летальных исходах - паренхиматозные органы, грудной и брюшной транссудат.

В период лептоспиремии (1-я неделя болезни) для обнаружения лептоспир проводится микроскопия цитратной крови, посев крови, определение специфической ДНК лептоспир в крови методом полимеразной цепной реакции (далее - ПЦР) и заражение лабораторных животных (постановка биопробы).

С конца 1-й, в начале 2-й недели в крови больных появляются специфические антитела, которые определяются серологическими реакциями:

микроагглютинации лептоспир (далее - РМА);

макроагглютинации на стекле (далее - РА);

непрямой реакции иммунофлюоресценции (далее - нРИФ);

иммуноферментного анализа (далее - ИФА).

Начиная со 2-й недели заболевания исследуют ликвор, с 3-й недели - мочу. В случае летальных исходов - паренхиматозные органы на присутствие лептоспир (микроскопия, посев, ПЦР, биопроба).

18. Метод прямой микроскопии.

Лептоспиры плохо воспринимают окраску, поэтому все наблюдения проводят с живыми возбудителями в темном поле зрения микроскопа. С этой целью используют конденсор темного поля (например, ОИ-13) и осветитель ОИ-19 или другой системы.

Для выявления лептоспир методом микроскопии готовят препараты "раздавленная капля": небольшую каплю исследуемого материала наносят пастеровской пипеткой на предметное стекло толщиной не более 1,0 - 1,1 мм и накрывают покровным стеклом толщиной 0,2 мм. На верхнюю линзу конденсора микроскопа помещают каплю дистиллированной воды.

Ввиду значительной величины микроба для исследования пользуются сухими системами: объектив - X40, окуляр - X10. Методом микроскопии исследуют цитратную кровь, мочу или ликвор больного, а также ткань паренхиматозных органов трупа.

Для приготовления цитратной крови смешивают 2 объема крови и один объем 1,5% раствора лимоннокислого натрия; смесь отстаивают при комнатной температуре в течение 2 часов. Микроскопируют надосадочную жидкость.

Более эффективна подготовка материала способом двойного центрифугирования.

На первом этапе проводят осаждение эритроцитов при 1000 об./мин в течение 15 мин. На втором этапе полученную надосадочную жидкость центрифугируют 30 мин при 10000 об./мин. Полученный осадок микроскопируют.

Метод микроскопии цитратной крови - простой и доступный метод ранней диагностики лептоспироза. Однако следует помнить, что ввиду его низкой чувствительности (10 клеток/мл) и кратковременности периода лептоспиремии (около 1 недели) отрицательные результаты микроскопии цитратной крови не дают основания для исключения диагноза лептоспироза.

На фоне антибиотикотерапии диагностическая эффективность микроскопического метода резко снижается.

Для подтверждения диагноза и определения серогруппы возбудителя кроме микроскопии необходимо проводить серологические и бактериологические исследования.

Мочу (средняя порция) и ликвор исследуют в нативном состоянии или осадок после центрифугирования.

Микроскопия мочи используется также с целью прижизненного обследования животных (в том числе свиней, собак и других) на лептоспироносительство.

Ткань паренхиматозных органов (печень, почки и другие) забирают пастеровской пипеткой и смешивают на предметном стекле с каплей физиологического раствора. Через 2 - 3 мин частицы ткани удаляют, каплю накрывают покровным стеклом и тотчас микроскопируют. Взвесь не должна быть слишком густой.

При исследовании почек взвесь готовят из коркового слоя органа, где локализуются лептоспиры.

Сходным образом готовят препараты для микроскопии из почек грызунов и других животных при их исследовании на лептоспироносительство.

При микроскопических исследованиях следует учитывать следующие возможные ошибки:

наличие в препарате образований (псевдоспирохет), по морфологии отдаленно напоминающих лептоспиры;

нитей фибрина, стром эритроцитов и так далее. От лептоспир их отличает отсутствие концевых крючков и активной подвижности;

наличие в препарате других извитых форм микроорганизмов, например спирилл, особенно часто обнаруживаемых при исследовании несвежего патологического материала;

дефекты покровного стекла при неправильной настройке микроскопа могут быть ошибочно приняты за лептоспиры;

плохое освещение препарата: при правильном освещении всегда видны пассивно или активно двигающиеся частицы.

Значительно реже для обнаружения лептоспир в органах и тканях используют окраску мазков-отпечатков по Романовскому-Гимза, импрегнацию серебром гистологических срезов по Вартину-Стерри. С этой же целью можно также использовать метод иммунофлуоресценции и полимеразную цепную реакцию.

19. Полимеразная цепная реакция.

В основе метода ПЦР лежит многократное копирование (амплификация) специфического фрагмента ДНК-мишени, который является маркерным для данного вида. Такое копирование осуществляется ферментом термостабильной ДНК-полимеразой в присутствии дезоксирибонуклеозид-трифосфатов (дНТФ) и синтетических олигонуклеотидных затравок синтеза ДНК, называемых праймерами. Праймеры комплементарны концевым последовательностям ДНК специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что синтез ДНК протекает только между ними. В результате происходит экспоненциальное увеличение числа копий специфического фрагмента n по формуле 2, где n - число циклов амплификации.

Каждый цикл состоит из трех этапов, каждому из которых соответствует определенный температурный режим:

расплетение двойной спирали ДНК (денатурация ДНК) происходит при 93 - 95 град. C;

присоединение (отжиг) праймеров происходит комплементарно при температуре, специфической для данной пары праймеров;

синтез новых цепей ДНК протекает при 72 град. C путем удлинения праймера в направлении 5' - 3'. В результате 30 - 35 циклов амплификации синтезируется 10 копий фрагмента, что делает возможным визуальный учет результатов после электрофореза в агарозном геле.

Необходимое оборудование и реактивы:

микропипетки полуавтоматические на 1 - 10, 5 - 40, 40 - 200, 200 - 1000 мкл;

микроцентрифуга на 8 - 12 тыс. об./мин для пробирок объемом 1,5 и 0,5 мл;

прибор для горизонтального электрофореза;

программируемый термостат (ДНК-амплификатор);

термостат на 45 - 55 град. C для пробирок объемом 1,5 мл;

ультрафиолетовый трансиллюминатор;

СВЧ-печь или водяная баня на 95 - 100 град. C;

встряхиватель для микропробирок (типа "Вортекс");

тест-системы для определения ДНК Leptospira interrogans методом ПЦР.

Техника обработки клинического материала и проведения анализа изложена в инструкциях по применению амплификационных тест-систем фирмы-изготовителя.

В качестве исследуемого клинического материала используют кровь, сыворотку крови, СМЖ, мочу.

ПЦР-анализ характеризуется высокой специфичностью, чувствительностью (от 10 до 1000 клеток в пробе) и высокой диагностической эффективностью на первой неделе заболевания (начиная с первых суток), даже на фоне антибиотикотерапии. Поэтому его можно рекомендовать как метод ранней экспресс-диагностики лептоспирозов.

При тяжелом течении инфекции на фоне отсроченного синтеза специфических антител ПЦР может быть отнесена к методам выбора для быстрого лабораторного подтверждения клинического диагноза.

Вместе с тем отрицательный результат ПЦР-анализа не должен быть основанием для прекращения диагностического поиска, так как день начала болезни не всегда точно известен.

Диагностическая чувствительность лабораторного анализа при лептоспирозах может быть значительно повышена за счет параллельного использования серологического теста (РМА) и ПЦР вне зависимости от фазы заболевания.

20. Бактериологическим методом исследуют тот же материал и в те же сроки, что и при использовании метода микроскопии.

Лептоспиры относятся к медленнорастущим микроорганизмам, поэтому выделение культуры имеет значение только для ретроспективного подтверждения клинического диагноза "лептоспироз" и более детальной расшифровки этиологии случая или вспышки.

Исследуемый материал от больного (кровь, моча, СМЖ) в количестве по 5 капель засевают в 3 - 5 пробирок с питательной средой или стерильной дистиллированной водой, желательно у постели больного.

При посеве из органов трупа человека или павшего сельскохозяйственного животного (почек, печени) после вскрытия брюшной полости во избежание загрязнения посевов шпателем осторожно прижигают поверхность органа. Затем в этом месте производят прокол пастеровской пипеткой на глубину 0,25 - 0,50 см и забирают межтканевую жидкость с элементами ткани, которые с соблюдением всех правил асептики переносят в пробирку или ампулу с питательной средой.

Трупы грызунов в связи с быстрым развитием трупного обсеменения исследуют в первые часы (не позднее 12 ч в зависимости от температуры воздуха) после гибели зверька. Грызунов вскрывают при строгом соблюдении асептики. Шкурку зверька смачивают 5-процентной спиртовой настойкой йода. Стерильными инструментами производят вскрытие брюшной полости. Почку извлекают и помещают в стерильную чашку Петри. Затем небольшие кусочки ткани почки, взятые пастеровской пипеткой, засевают на питательную среду. Инструменты в процессе вскрытия обжигаются.

Посевы следует производить в нескольких (3 - 5) пробирках или ампулах со средой, которые затем помещают в термостат и культивируют при температуре 28 - 30 град. C.

Для культивирования лептоспир используют жидкие сывороточные питательные среды, основным компонентом которых является сыворотка кролика или барана, а также полусинтетические твин-альбуминовые среды:

среда Терских. Для практического использования является наиболее простой и оптимальной.

Для приготовления 1 л основы этой среды к 100 мл фосфатного буфера (pH 7,2) добавляют 900 мл дистиллированной воды. Основу дважды фильтруют через двухслойный бумажный фильтр, разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют в автоклаве при 120 град. C в течение 20 мин; пробирки с выпавшим после автоклавирования кристаллическим или аморфным осадком выбраковывают.

В серии пробирок с прозрачным содержимым выборочно проверяют pH.

Для посевов используют среду с pH 7,2 - 7,6. В каждую пробирку добавляют в стерильных условиях инактивированную в течение 30 мин. при температуре 56 град. C нормальную кроличью сыворотку в количестве 0,5 мл (10 капель на 5 мл среды).

Приготовленная питательная среда может быть использована только после 2-кратного прогревания в водяной бане при 56 град. C в течение 1 ч. После каждого прогревания среда контролируется на стерильность (при 37 град. C в течение суток);

среда Фервоорта-Вольфа. В основу среды Фервоорта-Вольфа помимо компонентов, входящих в среду Терских, добавляют пептон (1 г на 1 л основы) и NaCl (0,5 г на 1 л основы);

твин-альбуминовая среда. Основные растворы. Растворяют следующие ингредиенты (в 100 мл дистиллированной воды каждый): NH4Cl - 25 г; ZnSO4 x 7H2O - 0,4 г; MgCl2 x 6H2O и CaCl2 x 2H2O по 1,5 г каждый; FeSO4 x 7H2O - 0,5 г; пируват натрия - 10,0 г; глицерин - 10,0 г; твин-80 - 10,0 г; тиамин HCl - 0,5 г и цианокобаламин - 0,02 г. Раствор FeSO4 должен быть свежеприготовленным и прозрачным.

Растворяют 10 г бычьего сывороточного альбумина (V фракция) в 50 мл дистиллированной воды, размешивают на магнитной мешалке, добавляя следующие растворы: CaCl2 - MgCl2 - 1 мл; FeSO4 - 10 мл; цианокобаламин - 1 мл; твин-80 - 12,5 мл. Доводят рH до 7,4 и добавляют дистиллированную воду до конечного объема 100 мл.

Альбуминовую добавку стерилизуют фильтрацией.

Для приготовления основы среды к 996 мл дистиллированной воды добавляют: Na2HPO4 (обезвоженный) - 1 г; K2HPO4 (обезвоженный) - 0,3 г и NaCl - 1 г. Затем добавляют следующие растворы: NH4Cl - 1 мл; тиамин - 1 мл; пируват натрия - 1,0 мл и глицерин - 1 мл. рH основы среды доводят до 7,4, а затем стерилизуют автоклавированием при 121 град. C в течение 20 мин.

Для приготовления жидкой твин-альбуминовой среды 1 объем альбуминовой добавки смешивают с 9 объемами основы среды при соблюдении асептики;

селективные среды. В качестве селективных могут быть использованы все перечисленные выше жидкие питательные среды после добавления в них 5-фторурацила в концентрации 100 мкг/мл.

21. Обработка посуды.

При культивировании лептоспир следует пользоваться посудой из нейтрального или химического стекла.

Обработка новой или бывшей в употреблении посуды производится в посудомоечной машине с использованием специальных детергентов или ручным способом. Процесс ручной обработки пробирок состоит из следующих этапов:

погружение на 24 часа в 1 - 2-процентный раствор соляной кислоты;

многократное (12 - 15 раз) промывание в проточной водопроводной воде;

обработка ершами в горячем мыльном растворе;

повторное многократное (12 - 15 раз) промывание в проточной водопроводной воде;

погружение в дистиллированную воду на 24 часа;

сушка и стерилизация.

22. Контроль роста культуры.

Лептоспиры размножаются в питательной среде, не изменяя ее внешнего вида. Среда остается прозрачной или слегка опалесцирующей в течение всего периода наблюдения. Поэтому для выявления роста лептоспир через 10 дней от момента посева из каждой пробирки или ампулы готовят "раздавленную каплю" и микроскопируют в темном поле. При обнаружении лептоспир в пробирках их содержимое засевают по 0,5 мл (10 капель) в три пробирки с 5 мл свежей питательной среды в каждой. Посевы помещают в термостат на 7 - 10 дней при температуре 28 - 30 град. C.

В случае получения хорошего роста (50 - 100 лептоспир в поле зрения при увеличении x400) культуры используют как рабочие музейные штаммы (для последующей идентификации) и составляют на них паспорт.

Пробирки, где рост лептоспир не выявлен, вновь помещают в термостат и микроскопируют через каждые 10 дней. При отсутствии роста в течение трех месяцев посевы считают отрицательными.

Рост лептоспир в жидких питательных средах контролируют микроскопией, а также макроскопически - просмотром пробирок с культурами в луче света от осветителя. При осторожном встряхивании в питательной среде четко просматриваются опалесцирующие "муаровые" волны, образуемые выросшей культурой.

При выращивании клеток в пробирках с полужидкой средой (0,2% агара) на 1 - 3 см ниже ее поверхности образуются характерные плоские диски роста (феномен Дингера) или отдельные диффузно расположенные колонии.

На 1-процентной агаровой среде в чашках Петри лептоспиры образуют субповерхностные колонии.

Штаммы хранят в соответствии с инструкцией хранения патогенных микробов при комнатной температуре и пересевают один раз в месяц.

Аналогичным способом контролируют рост культур диагностических штаммов, предназначенных для серологических исследований.

23. Хранение культур лептоспир.

Штаммы лептоспир, постоянно поддерживаемые в лаборатории, можно хранить в пробирках под вазелиновым маслом или в запаянных ампулах. Лептоспиры консервируют после выращивания в сывороточной среде до максимального накопления. В пробирку на культуру наслаивают 0,25 мл или 5 капель стерильного вазелинового масла или культуру разливают в стерильные ампулы (1 - 5 мл) из нейтрального стекла и запаивают. Хранят пробирки и ампулы в темном месте при комнатной температуре. В таких условиях лептоспиры можно хранить без пересевов в течение шести месяцев.

Для длительного хранения штаммов используют также полужидкие среды, содержащие 0,2% агара.

При необходимости длительного сохранения лептоспир их помещают в паровую (-168 град. C) или жидкую фазу (-196 град. С) жидкого азота. Предварительно культуру с добавленным стерильным глицерином в конечной концентрации 5 - 10% охлаждают со скоростью 35 или 60 об./мин (от 0 до 130 град. C).

Рабочие музейные штаммы можно хранить и при -70 град. C. В этом случае нет необходимости добавлять глицерин в среду.

24. Дифференциация патогенных лептоспир от сапрофитных проводится по результатам биопробы и культурально-биохимическим тестам. Из них наиболее простыми являются выращивание культур при температуре 13 град. C или в присутствии 8-азагуанина в концентрации 225 мкг/мл. В отличие от патогенных, сапрофитные лептоспиры в этих условиях хорошо размножаются.

25. Метод биопробы в диагностике лептоспирозов используется редко. Заражение животных подозрительным на наличие лептоспир материалом можно использовать с целью:

выделения культур лептоспир из контаминированного посторонней микрофлорой материала (ткани органов, моча, вода открытых водоемов, почва и так далее);

очистки культур патогенных лептоспир от посторонней микрофлоры;

определения вирулентности штаммов лептоспир;

исследования воды открытых водоемов на наличие патогенных лептоспир.

Универсальной лабораторной модели для воспроизведения заболеваний различными сероварами лептоспир не существует. Оптимальной моделью для воспроизведения иктерогеморрагического лептоспироза служат морские свинки массой 150 - 200 г, у которых заболевание протекает в первые дни с подъемом температуры до 40 - 41 град. С и резким падением веса. На 5-й - 10-й день после инфицирования высоковирулентным штаммом появляется желтушная окраска склер, видимых слизистых оболочек и кожи. Животные погибают через 12 - 48 часов после появления желтухи при явлении гипотермии. На вскрытии обнаруживается увеличение почек и геморрагии во внутренних органах, коже и подкожной клетчатке. Особенно типичны крупноточечные кровоизлияния в легочной ткани на общем ишемическом фоне ("крылья бабочки"). К лептоспирам других серологических групп морские свинки менее восприимчивы и чувствительны.

Более универсальная модель для воспроизведения экспериментального лептоспироза, вызванного возбудителями различных сероваров, - золотистые хомячки массой 25 - 40 г. Исследуемый материал вводят животным внутрибрюшинно, подкожно, внутривенно, через скарифицированную кожу и слизистые оболочки. В случае появления клинической картины или гибели животных в острой фазе после аутопсии производят посев из внутренних органов (печени, почек). За животными, не погибшими в первые дни от инфекции, наблюдают в течение месяца. По истечении этого срока их умерщвляют (с учетом требований биоэтики) и производят посевы из коркового слоя почек; из сердца берут кровь (нативную или на фильтровальную бумагу) для исследования на наличие специфических антител с помощью реакции микроагглютинации лептоспир (РМА).

Исследование воды на наличие патогенных лептоспир. Золотистым хомячкам или молодым морским свинкам вводят внутрибрюшинно соответственно 1,0, 10 и 10 мл пробы. Предварительно пробы воды (50,0 мл) можно центрифугировать (в течение 20 мин при 10000 об/мин). Полученным осадком заражают животных (вводят 2 - 3 мл). Наблюдение за животными и исследование их органов на наличие лептоспир проводят, как описано выше. Ввиду отсутствия лабораторных животных, восприимчивых ко всем эпидемически значимым сероварам лептоспир, а также их низкой концентрации в пробах выделение возбудителей из воды открытых водоемов удается с трудом и требует больших затрат времени и средств. Отрицательные результаты исследования проб не являются основанием для исключения воды как фактора передачи возбудителя инфекции.

Глава 7 ИММУНО-СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

26. Серологические исследования - основа лабораторной диагностики лептоспирозов. В мировой практике "золотым стандартом" остается реакция микроагглютинации лептоспир, отличающаяся высокой чувствительностью и специфичностью. Кроме того, РМА позволяет определить серогруппу возбудителя, что важно для последующего проведения эпидемиологического обследования.

С целью серологического скрининга и ранней диагностики лептоспирозов используются также более простые тесты (реакция слайд-агглютинации, иммуноферментный анализ и другие) с родоспецифическими антигенами лептоспир.

Агглютинины в сыворотке крови больных лептоспирозом обнаруживаются в низких разведениях (1:20) начиная с 4-го, но чаще на 7-й - 8-й день болезни. Титры антител достигают максимума, как правило, на 14-й - 17-й день, а затем постепенно снижаются. Однако у некоторых больных, например при тяжелом клиническом течении лептоспирозной инфекции, особенно на фоне интенсивной антибиотикотерапии, наблюдается иммуносупрессия (серогенативные случаи) или отсроченный синтез специфических антител, которые появляются лишь спустя 2 - 3 месяца от начала болезни.

Это важное обстоятельство необходимо учитывать при оценке результатов лабораторной диагностики спорадических случаев лептоспирозов (особенно иктерогеморрагического), когда выявляются в основном клинически тяжелые случаи. Агглютинины в сыворотке крови переболевших лептоспирозом обнаруживаются в течение 3 - 5 лет и даже в более отдаленные сроки после перенесенного заболевания, что используется для ретроспективной диагностики и изучения иммунологической структуры населения.

В случаях спорадических заболеваний сыворотку больных необходимо исследовать в динамике не менее двух раз: первый - при поступлении больного в стационар (даже если это первый день болезни), второй - через 5 - 7 дней. При необходимости исследование можно повторить на 3-й - 4-й неделе болезни. Нарастание титров антител даже в невысоких разведениях (1-й результат - отрицательный, 2-й результат - титр 1:20) является абсолютным доказательством наличия заболевания.

У больных с типичной клиникой лептоспироза, характерным эпидемиологическим анамнезом, но отрицательными результатами серологического исследования лабораторное обследование следует повторить перед выпиской из стационара. При наличии поздних осложнений в процессе диспансерного наблюдения за реконвалесцентом обследование можно повторять в течение 3 - 6 месяцев.

При вспышке лептоспироза достаточно однократного исследования. При этом подтверждением лептоспирозной этиологии вспышки служит выявление у больных и переболевших антител в титрах от 1:100 и выше (соответственно срокам болезни).

27. Реакция микроагглютинации лептоспир.

Для  постановки  РМА  используют  живые  культуры лептоспир 6  - 14-
                                                   7     8
дневного  возраста   плотностью   не  менее  5 x 10  - 10  клеток/мл
(50  -  100 лептоспир в поле зрения микроскопа при
увеличении в x 400), с хорошей подвижностью клеток,  без  спонтанной
агглютинации   и    посторонних   примесей   (осадок,   контаминация
посторонней микрофлорой).

Каждую сыворотку исследуют со всеми референтными штаммами, представляющими серогруппы патогенных лептоспир, циркулирующих в данной местности. Для диагностики лептоспироза на территории Республики Беларусь рекомендован стандартный набор диагностических штаммов лептоспир согласно таблице 1.

Международный набор референс-штаммов, рекомендуемый для использования в специализированных лабораториях лептоспирозов, дополнительно содержит штаммы серогрупп лептоспир, ранее не выделявшихся на территории Беларуси, согласно таблице 2.

При серологическом исследовании используют нативную сыворотку, консервированную (например, мертиолятом натрия в разведении 1:10000) или без консерванта.

В РМА можно также исследовать пробы крови больных людей или животных, высушенные на фильтровальной бумаге. В этом случае кровь в количестве 2 капель (каждая размером 15 - 20 мм) наносят на фильтровальную бумагу и высушивают на воздухе. Для постановки реакции эти участки фильтровальной бумаги вырезают, разрезают и опускают на дно пробирки. В пробирку добавляют 10 капель физиологического раствора и оставляют на 1 ч при комнатной температуре. Полученный раствор служит основным разведением 1:10, из которого готовят последующие разведения.

Исследовать сухие капли необходимо в срок, не превышающий одного месяца с момента взятия крови, при условии хранения их при комнатной температуре, и в течение 6 месяцев - в запаянном полиэтиленовом пакете в холодильнике при 4 град. C.

Для постановки РМА сыворотку больного исследуют одновременно в двух разведениях 1:10 и 1:100 (при смешивании с культурой 1:20 - 1:200), чтобы исключить феномен прозоны. В случае положительной реакции определяют конечный титр сыворотки.

При вскрытии трупов грызунов кровь забирают из сердца с помощью пастеровской пипетки. Сыворотки грызунов исследуют сначала в одном разведении 1:10 (с культурой 1:20) и титруют с двукратным шагом, если реакция положительная.

Разведенная сыворотка и живая культура лептоспир из диагностического набора штаммов смешиваются в равных объемах (по 0,1 мл) в лунках полистироловых планшет. В качестве контроля используют смесь равных объемов физиологического раствора и культуры лептоспир. Планшеты встряхивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре, после чего проводят окончательный учет реакции в препаратах "раздавленная капля" под микроскопом в темном поле зрения (при увеличении x 200 или x 400). Вследствие добавления к испытуемой сыворотке равного объема живой культуры лептоспир разведение сыворотки удваивается.

При массовых серологических исследованиях, особенно сывороток животных, РМА удобно ставить на предметном стекле, на котором смешивают по 1 капле разведенной сыворотки и культуры диагностических штаммов лептоспир.

Смесь накрывают покровным стеклом и после 15-минутной экспозиции при комнатной температуре проводят учет реакции под микроскопом. На каждом стекле можно поставить три реакции.

Агглютинация проявляется в форме склеивания лептоспир и образования своеобразных конгломератов в виде "паучков", "бантиков", "кос".

Учет реакции проводят визуально по условной системе оценок трех крестов.

Контроль: агглютинация отсутствует, все клетки лептоспир находятся в свободном состоянии;

+ - примерно 1/3 лептоспир (по сравнению с контролем) агглютинированы;

++ - от 1/3 до 2/3 лептоспир агглютинированы;

+++ - агглютинированы почти все или все лептоспиры.

При исследовании сывороток крови больных и переболевших людей и анализе результатов серологических исследований примерно в 60% испытуемых образцов, особенно на 1-й - 2-й неделе заболевания, наблюдаются межгрупповые реакции, затрудняющие установление этиологического агента.

Например, исследуемая сыворотка больного агглютинировала штамм М-20 (серогруппа Icterohaemorrhagiae) до разведения 1:200, штамм Pomona (серогруппа Pomona) до 1:1600 и штамм Perepelicin (серогруппа Tarassovi) до 1:100. Следует заключить: лептоспироз, обусловленный возбудителем серогруппы Pomona.

Если же сыворотки больных реагируют только с одним из диагностических штаммов, также ставят серогрупповой диагноз. Например, в сыворотке больного обнаруживают антитела к штамму Moskva V в разведении 1:800. Диагноз: лептоспироз, вызванный лептоспирами серогруппы Grippoty-phosa.

В ряде случаев в первые дни болезни титр антител к неспецифическому возбудителю превышает таковой к этиологическому агенту заболевания (парадоксальные реакции), но на более поздних сроках выявляются только специфические антитела к возбудителю болезни. Например, при лептоспирозе, вызываемом лептоспирами серогруппы Pomona, в первые дни болезни часто обнаруживаются антитела только к лептоспирам Australis, титр которых быстро снижается. Исследование парных сывороток помогает установить серогруппу возбудителя.

Для суждения об истинной роли той или иной серогруппы лептоспир в качестве этиологического агента у конкретного больного иногда прибегают к определению класса антител. При этом исходят из того, что антитела класса IgG отличаются большей специфичностью, чем IgM, и в 85% случаев реагируют только с гомологичным антигеном.

Для выявления патогенных лептоспир и антител к ним в реакции микроагглютинации на стекле используют диагностический набор "Лепт-АгАт" производства ГУ "НИИЭМ". Набор содержит 7 инактивированных культур микробных клеток стандартных диагностических штаммов Leptospira interrogans наиболее распространенных в республике серогрупп (Icterohaemorragiae, Australis, Canicola, Pomona, Grippotyphosa, Tarassovi, Hebdomadis) и 7 групповых агглютинирующих сывороток к ним. Постановка реакции производится согласно инструкции по применению.

28. Реакция макроагглютинации на стекле (слайд-агглютинация). Реакцию макроагглютинации на стекле используют для обнаружения антител к лептоспирам различных сероваров и серогрупп в сыворотке крови больных лептоспирозом, используя родоспецифические антигены лептоспира Байрам-Али СЛАЙД-АНТИГЕН (далее - БАСА). Обычно РА используется для предварительного тестирования сывороток больных с подозрением на лептоспирозную инфекцию и массового скрининга.

Постановка реакции:

на чистое предметное стекло автоматической пипеткой наносят 10 мкл испытуемой сыворотки, разведенной физиологическим раствором в соотношении 1:1, и 10 мкл слайд-антигена (после встряхивания виалы). Сыворотку и антиген смешивают бактериологической петлей;

спустя 2 - 4 мин в проходящем свете осветителя ОИ-19 или с помощью вогнутого зеркала проводят оценку реакции: при положительном результате наблюдается образование четко видимых агглютинатов при одновременном просветлении реакционной смеси;

если реакция агглютинации на стекле положительна или сомнительна, то сыворотку рекомендуется исследовать дополнительно в РМА.

Контроли:

положительная контрольная сыворотка, которая дает четкую агглютинацию со слайд-антигеном в реакции макроагглютинации при постановке указанным методом;

контроль антигена - БАСА смешивается с растворителем сывороток или физиологическим раствором в указанных выше соотношениях;

испытуемые сыворотки должны быть свободны от контаминации и консервантов. Инактивация сывороток не обязательна.

29. Реакция непрямой иммунофлюоресценции (далее - нРИФ). Метод нРИФ используют для выявления родоспецифических антител к лептоспирам различных сероваров и серогрупп в сыворотке крови больных лептоспирозом, используя иммобилизованный на стекле лептоспирозный антиген и высокоактивный специфический конъюгат. В качестве антигена используют смесь культур диагностических штаммов лептоспир различных серогрупп L. interrogans, циркулирующих на данной территории. В качестве конъюгата - антивидовую сыворотку, содержащую антитела против иммуноглобулинов человека (Ig M, Ig G или суммарные), меченые флюоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ).

нРИФ используется для предварительного тестирования сывороток больных с подозрением на лептоспирозную инфекцию и массового скрининга при проведении ретроспективного и текущего сероэпидемиологического обследования. При необходимости выяснения серогруппы (серовара) возбудителя, вызвавшего заболевание, проводится тестирование сывороток больных дополнительно в РМА.

Постановка реакции:

стекла с иммобилизованным антигеном перед использованием ополаскивают дистиллированной водой и высушивают (из тест-системы);

положительную контрольную сыворотку -К+ (из тест-системы) и подготовленные тестируемые сыворотки больных автоматической пипеткой вносят в лунки стекол в объеме 10 мкл;

инкубируют во влажной камере при 37 град. C и течение 30 минут;

по окончании инкубации стекла отмывают фосфатно-солевым буфером (ФСБ), pH 7,2 - 7,4 (из тест-системы) в течение 2 минут, двукратно. После отмывки стекла ополаскивают дистиллированной водой и высушивают под струей воздуха в наклонном положении;

затем в каждую лунку автоматической пипеткой вносят по 10 мкл конъюгата с Эвансом голубым в рабочем разведении (из тест-системы);

инкубируют во влажной камере при 37 град. C в течение 30 минут;

по окончании инкубации стекла снова ополаскивают дистиллированной водой, двукратно в течение 2 минут отмывают ФСБ, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают, как описано выше;

препараты исследуют в люминесцентном микроскопе типа "Люмам" с водно-иммерсионным объективом х60, тубусом х1,6 и окуляром х8 или масляным иммерсионным объективом х90, тубусом х1,1 и окуляром х8. Результаты учитывают на основании оценки яркости и тона свечения микробных клеток с характерной морфологией в сравнении с положительным контролем. Четко выраженная изумрудно-зеленая окраска большинства лептоспир рассматривается как положительный результат. Слабое зеленоватое или желтоватое свечение антигена, а также отсутствие люминесценции оценивается как отрицательный результат;

титр антител в сыворотке крови больного, равный 1:64 и выше, считается значимым для постановки диагноза "лептоспироз". Больные, клинический материал которых имел при обследовании титры антител ниже диагностических, нуждаются в повторном обследовании спустя 1 - 2 недели.

При оценке результатов нРИФ следует учитывать следующее:

ложноотрицательный результат может быть получен у больных сифилисом и клещевым боррелиозом (болезнь Лайма), поэтому при постановке окончательного диагноза "лептоспироз" целесообразно исключить эти инфекции на основании анамнеза и клинической картины заболевания;

ложноотрицательные результаты могут иметь место, если кровь была взята до 7 дней от начала заболевания, когда титры противолептоспирозных антител еще не достигли диагностического уровня;

ранняя антибиотикотерапия может вызвать уменьшение или задержку выработки противолептоспирозных антител у больного;

в случаях спорадического заболевания кровь больного необходимо исследовать не менее двух раз: первую пробу - в первые 3 дня заболевания, вторую - не ранее 10-го дня. Нарастание титров антител в 4 и более раз даже в невысоких разведениях является доказательством наличия заболевания;

при вспышке в очагах лептоспироза у больных достаточно однократного исследования сыворотки крови. При этом подтверждением лептоспирозной этиологии заболевания служит выявление у больных и переболевших антител в титрах от 1:16 и выше;

результаты лабораторного анализа на лептоспироз должны быть интерпретированы в связи с эпидемиологическими данными, в том числе нахождением больного на эндемичных территориях по лептоспирозу, клиническими симптомами заболевания и результатами других лабораторных исследований.

Для выявления суммарных антител к возбудителю лептоспироза в сыворотке крови человека применяется иммунофлюоресцентный метод Лепто-ФлюоСкрин производства ГУ "НИИЭМ". Тест-система представляет собой смесь штаммов лептоспир основных для республики серогрупп, иммобилизованных на поверхности лунок предметных стекол для постановки реакции иммунофлюоресценции. Постановка реакции производится согласно инструкции по применению.

30. Иммуноферментный анализ (далее - ИФА).

Метод ИФА очень чувствительный, но в меньшей степени серовароспецифичный тест по сравнению с РМА. В настоящее время существует несколько его вариантов, позволяющих определять у больного титры lgG- и lgM-антител к различным сероварам L. interrogans.

Использование родоспецифического антигена дает возможность обнаружить антитела к разным сероварам. Применение в качестве антигена экстракта наружной оболочки лептоспир, напротив, позволяет идентифицировать серотип вызвавшего инфекцию возбудителя.

ИФА выявляет неагглютинирующие родо- и видоспецифические антитела у больного на 3 - 5 дн. раньше, чем РМА. Диагностическим считается титр антител 1:320.

Техника обработки клинического материала (кровь, сыворотка, ликвор) и проведения анализа изложены в инструкциях по применению конкретных иммуноферментных тест-систем фирм-изготовителей.

ИФА характеризуется высокой специфичностью, чувствительностью (до 99%) и высокой диагностической эффективностью на первой неделе заболевания, когда специфические агглютинины еще не достигают диагностического титра. Метод ИФА используется для экспресс-диагностики лептоспироза.

Глава 8 ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВЫДЕЛЕННОЙ КУЛЬТУРЫ

31. Выделенные на местах штаммы лептоспир идентифицируются до серогруппы с помощью набора диагностических агглютинирующих сывороток.

Идентификацию выделенных штаммов проводят с помощью перекрестной РМА. Для этого необходимо располагать гипериммунными специфическими сыворотками против испытуемого и эталонных штаммов лептоспир. Их перечень соответствует списку диагностических штаммов.

Штаммы относят к одной серогруппе, если титры РМА изучаемого штамма с референс-антисывороткой и референс-штамма с антисывороткой к изучаемому штамму превышают 10%.

Серогруппы не имеют официального таксономического статуса. Поэтому следующим этапом идентификации является определение серовара лептоспир (основной таксон).

После выяснения серогрупповой принадлежности штамма исследования проводят в перекрестной РМА, но уже со штаммами, представляющими все серовары серогруппы, к которой выделенный штамм проявил наибольшее сродство.

Эталонные штаммы и антисыворотки к ним, прореагировавшие хотя бы с одной стороны на 10% и более, отбирают для сравнения их с опытным штаммом в перекрестных реакциях абсорбции. Идентификацию штаммов лептоспир на уровне серогруппы, серовара и субсеровара можно проводить также в РМА с панелями моноклональных антител.

32. Выделенные от людей, животных или объектов внешней среды культуры лептоспир следует направлять для идентификации в Сотрудничающий Центр ВОЗ и Минздрава Республики Беларусь по лептоспирозам на базе лабораторий, занимающихся проблемами лептоспироза, РЦГЭиОЗ и ГУ НИИЭМ.

Глава 9 ПРОФИЛАКТИКА ЛЕПТОСПИРОЗА

33. Профилактика лептоспироза основана на комплексе медико-санитарных и ветеринарно-санитарных мероприятий. Перечень общих профилактических мероприятий, обязательных для выполнения на территории Республики Беларусь всеми органами государственного управления, предприятиями, колхозами, совхозами, учреждениями, организациями, независимо от форм собственности и подчиненности, общественными объединениями, должностными лицами и гражданами, определен санитарными правилами (СП 17-122 РБ 99) и ветеринарными правилами (ВП 10-1-5-454 РБ 99).

Вопросы профилактики лептоспироза включаются в территориальные программы (планы) по вопросам санитарно-эпидемиологического благополучия населения и профилактики особо опасных инфекций. При составлении плана мероприятий учитывается эпидемическая и эпизоотическая ситуация в данной местности, выясняется этиологическая структура заболеваний, наличие природных очагов, численность грызунов, ветеринарно-санитарное состояние животноводческих хозяйств, использование водоемов при размещении летних лагерей для скота, осуществление программы мелиорации и др.

34. Профилактика лептоспироза в зависимости от типов очагов.

Мероприятия по профилактике и борьбе с лептоспирозом проводятся дифференцированно в зависимости от типа очага.

Природные очаги. Мероприятия в природных очагах сводятся к их выявлению и оздоровлению. Поиск эпизоотий проводится в местах возможного заражения людей и животных.

При отсутствии заболеваний зараженных зверьков следует искать в сырых заболоченных угодьях, прежде всего в местах, используемых населением для хозяйственных нужд (пастбища, территории, где проводятся гидротехнические и мелиоративные работы, освоение новых территорий, трассы перегона скота на отгонное пастбище, различные поисковые работы и др.) и отдыха. При обнаружении зараженных зверьков выясняются интенсивность эпизоотии и размеры охваченной ею территории.

После этого разрабатываются конкретные мероприятия по оздоровлению данного очага в зависимости от его эпидемической и эпизоотической значимости. Предусматривается проведение при необходимости гидромелиоративных работ, а также дератизации в жилых помещениях, животноводческих хозяйствах (фермах), зернохранилищах и др. с целью подавления численности и предупреждения миграции зараженных зверьков. Большое значение имеет обеспечение грызунонепроницаемости помещений (жилых, хозяйственных, промышленных), повышающее эффективность противолептоспирозных мероприятий.

Лицам при работе на территории природных очагов лептоспироза следует соблюдать правила личной профилактики (использовать резиновую обувь, перчатки, следить за тем, чтобы не было порезов рук и ног и так далее), а постоянно работающим прививаться против лептоспироза. Осуществляется строгий контроль за хранением и доставкой питьевой воды и пищевых продуктов. Запрещается употребление для питья некипяченой воды из открытых водоемов и купание.

На территории природных очагов лептоспироза не разрешается выпас и прогон сельскохозяйственных животных, не привитых против этой инфекции.

С целью оздоровления природных очагов иктерогеморрагического лептоспироза проводятся дератизационные работы на эпидемически значимых объектах, в населенных пунктах и открытых стациях.

Совместно с заинтересованными ведомствами и учреждениями обеспечивается проведение необходимого комплекса санитарно-технических, санитарно-гигиенических мероприятий по дератизации и снижению численности бродячих собак.

Хозяйственные очаги. В хозяйственных очагах основные усилия сосредоточиваются на оздоровлении животноводческих хозяйств, выявлении и лечении животных-лептоспироносителей, строгом соблюдении ветеринарно-санитарных правил в животноводческих и звероводческих хозяйствах, фермах, питомниках для служебных собак и др., упорядочении водопоя животных и обеззараживании продуктов животноводства, организации регулярной дератизации, а также соблюдении мер личной профилактики при уходе за животными, убое и пр.

Особое внимание уделяется охране водоемов от загрязнения выделениями больных животных и лептоспироносителей. Не разрешается строительство животноводческих помещений и лагерное содержание сельскохозяйственных животных на берегу водоемов без соблюдения соответствующих правил по охране водоемов. Устанавливается строгий санитарный контроль за источниками централизованного водоснабжения, а также за местами купания людей, водопоя скота и спуском сточных вод от животноводческих ферм.

Хозяйство (ферма, отделение, гурт, индивидуальный двор и так далее), в котором диагностирован лептоспироз, в установленном порядке объявляется неблагополучным.

План оздоровительных мероприятий разрабатывается главным ветеринарным врачом административной территории, согласовывается с главным врачом центра гигиены и эпидемиологии и утверждается главой администрации.

В соответствии с действующими инструкциями в хозяйстве вводятся ограничения и устанавливается строгий контроль за их соблюдением.

Молоко, получаемое от больных лептоспирозом животных, нагревается до кипения и употребляется в корм животным.

Грубые корма, в которых обнаружены зараженные лептоспирами грызуны, скармливают только животным, вакцинированным против лептоспироза.

Вскрытие и снятие шкур с убитых или павших животных проводится с соблюдением мер личной профилактики.

За работниками хозяйства устанавливается медицинское наблюдение, вплоть до снятия с хозяйства ограничений. Снятие с неблагополучного хозяйства ограничений оформляется актом и проводится под контролем главного ветеринарного врача района, о чем информируется центр гигиены и эпидемиологии.

Перед снятием ограничений в хозяйстве проводятся механическая очистка и заключительная дезинфекция. Обеззараживанию подвергаются станки (стойла), выгульные площадки и другие места содержания животных, которые могли быть инфицированы мочой лептоспироносителей.

В неблагополучных животноводческих хозяйствах, в убойных и субпродуктовых цехах мясокомбинатов, на санитарных бойнях персонал должен быть привит против лептоспироза, работать в специальной одежде: халатах (комбинезонах), резиновых перчатках, сапогах, фартуках и при необходимости пользоваться защитными очками.

По окончании работ спецодежда дезинфицируется 2-процентным раствором хлорамина, руки обеззараживаются этим же препаратом и затем моются с мылом.

Запрещается прием пищи, воды, курение во время работы. Для приема пищи отводится специальное помещение, где должны быть умывальники, 2-процентный раствор хлорамина для обработки рук и закрытые бачки с питьевой водой.

Проводятся дератизационные мероприятия, а также мероприятия по защите от грызунов водоисточников, колодцев, емкостей для хранения воды (баки, цистерны и др.), пищевых продуктов в складских помещениях и в домашних условиях. При работе соблюдаются правила личной профилактики.

Смешанные очаги лептоспироза. В смешанных очагах лептоспироза мероприятия проводятся по типу как природных, так и хозяйственных очагов, и в зависимости от их интенсивности усиливаются те или иные мероприятия.

В очагах лептоспироза любого типа, и в первую очередь в неблагополучных населенных пунктах и хозяйствах, медицинским и ветеринарным работникам, руководителям хозяйств следует постоянно проводить работу по санитарно-гигиеническому образованию в области профилактики лептоспироза среди населения и групп профессионального риска, в том числе через средства массовой информации.

Занятия должны проводиться дифференцированно по специальным программам для каждой из этих групп.

Вопросы личной профилактики лептоспироза включаются в санитарный минимум или вводный инструктаж для работников мясокомбинатов, животноводческих хозяйств, канализационных сооружений и других групп профессионального риска. Рекомендуется не реже одного раза в два года проводить семинары по вопросам эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики лептоспироза для врачей лечебно-профилактических организаций и центров гигиены и эпидемиологии. Обеспечить регулярную подготовку на рабочих местах бактериологов на базе специализированных лабораторий.

35. Специфическая иммунопрофилактика.

Иммунизация против лептоспироза населению проводится по эпидемическим показаниям.

Иммунизации подлежат лица, относящиеся к группам профессионального риска заражения (в любое время года), персонал лабораторий, работающих с патогенными лептоспирами, а также лица, направляемые на строительные и сельскохозяйственные работы в места активно действующих природных и хозяйственных очагов лептоспироза (не позднее чем за месяц до начала работ). Контингенты риска и время иммунизации определяются территориальными центрами гигиены и эпидемиологии.

Проведение прививок определяется местными органами здравоохранения в зависимости от эпидемической и эпизоотической ситуации. Для этого анализируется состояние заболеваемости людей и сельскохозяйственных животных (совместно с ветеринарной службой) за последние годы в каждом населенном пункте.

В выявленных очагах лептоспироза иммунизируются лица повышенного риска инфицирования: ветеринарные работники, зоотехники, телятницы, свинарки, доярки, собаководы, рабочие, занятые оборудованием или ремонтом стойловых помещений и транспортированием животных, кормов и пр., работники очистных канализационных сооружений, складских помещений, рыбоводческих хозяйств, шахтеры и др. Первостепенное внимание уделяется работникам субпродуктовых и убойных цехов мясокомбинатов, санитарных боен и убойных пунктов. Прививкам также подлежит персонал различных учреждений и организаций, работающих с мелкими млекопитающими в полевых условиях в природных очагах лептоспироза. Все эти контингенты можно прививать в любое время года.

Прививки проводятся в соответствии с наставлением по применению лептоспирозной вакцины.

36. Экстренная профилактика.

В целях экстренной антибиотикопрофилактики лептоспироза лицам, подвергшимся риску заражения, назначается доксициклин (вибрамицин) по следующей схеме: 1 капсула (0,1 г) один раз в день в течение 5 дней. Решение о проведении экстренной профилактики принимается территориальными центрами органов здравоохранения и центрами гигиены и эпидемиологии.

При попадании возможно инфицированного материала (при забое животных и т.п.) на кожные покровы немедленно проводится их обработка 5-процентным раствором йода. Слизистые оболочки глаз необходимо промыть 1-процентным раствором борной кислоты, струей воды и ввести в глаза несколько капель 1-процентного раствора азотнокислого серебра; в нос ввести 1-процентный раствор протаргола; рот и горло прополоскать 0,05-процентным раствором марганцовокислого калия или 1-процентным раствором борной кислоты.

Приложение 1
к Инструкции
о клинике, лечении,
лабораторной диагностике и
профилактике лептоспироза

КЛИНИКО-ПАТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ КЛАССИФИКАЦИЯ ЛЕПТОСПИРОЗА

-----------+------------+----------+-------------------+---------------
¦  Формы   ¦   Ведущие  ¦ Тяжесть  ¦       Течение     ¦       Исходы      ¦
¦          ¦  синдромы  ¦          ¦                   ¦                   ¦
+----------+------------+----------+-------------------+-------------------+
¦      1   ¦      2     ¦     3    ¦          4        ¦         5         ¦
+----------+------------+----------+-------------------+-------------------+
¦1. Желтуш-¦1. Гепаторе-¦1. Легкая ¦1. Острое без реци-¦1. Выздоровление   ¦
¦ная       ¦нальный     ¦2. Средне-¦дивов              ¦2. С обратимыми из-¦
¦          ¦2. Геморра- ¦тяжелая   ¦2. Острое с реци-  ¦менениями (дли-    ¦
¦          ¦гический    ¦3. Тяжелая¦дивами             ¦тельная астения,   ¦
¦          ¦3. Менинге- ¦          ¦3. Острое и затяж- ¦некронефроз, гепа- ¦
¦          ¦альный      ¦          ¦ное с осложнениями:¦тоз, парезы, ириты,¦
+----------+------------+          ¦а) специфическими: ¦иридоциклиты, по-  ¦
¦2. Безжел-¦1. Ренальный¦          ¦острая почечная не-¦мутнение стекловид-¦
¦тушная    ¦2. Менинге- ¦          ¦достаточность      ¦ного тела и др.)   ¦
¦          ¦альный      ¦          ¦(ОПН), острая по-  ¦3. С необратимыми  ¦
¦          ¦3. Геморра- ¦          ¦чечно-печеночная   ¦изменениями (пара- ¦
¦          ¦гический    ¦          ¦недостаточность    ¦личи, потеря остро-¦
¦          ¦            ¦          ¦(ОППН), уремическая¦ты зрения, хрониче-¦
¦          ¦            ¦          ¦кома; кровотечения:¦ская почечная недо-¦
¦          ¦            ¦          ¦(внутренние и на-  ¦статочность        ¦
¦          ¦            ¦          ¦ружные); острая    ¦(ХПН))             ¦
¦          ¦            ¦          ¦сердечно-сосудистая¦4. Летальный исход ¦
¦          ¦            ¦          ¦недостаточность    ¦и его причины:     ¦
¦          ¦            ¦          ¦(ОССН); отек мозга;¦а) острая почечная ¦
¦          ¦            ¦          ¦ириты, иридоцик-   ¦недостаточность    ¦
¦          ¦            ¦          ¦литы, помутнение   ¦(ОПН);             ¦
¦          ¦            ¦          ¦стекловидного тела;¦б) острая почечно- ¦
¦          ¦            ¦          ¦астеновегетативный ¦печеночная недоста-¦
¦          ¦            ¦          ¦синдром и др.      ¦точность (ОППН);   ¦
¦          ¦            ¦          ¦б) неспецифичес-   ¦в) кровотечения;   ¦
¦          ¦            ¦          ¦кими (вторичными): ¦г) острая сердечно-¦
¦          ¦            ¦          ¦гнойные паротиты,  ¦сосудистая недоста-¦
¦          ¦            ¦          ¦отиты, гингивиты,  ¦точность (ОССН);   ¦
¦          ¦            ¦          ¦менингиты; гипоста-¦д) отек мозга      ¦
¦          ¦            ¦          ¦тические пневмонии ¦                   ¦
¦          ¦            ¦          ¦и др.              ¦                   ¦
¦----------+------------+----------+-------------------+--------------------

Приложение 2
к Инструкции
о клинике, лечении,
лабораторной диагностике и
профилактике лептоспироза

НАБОР ЭТАЛОННЫХ ШТАММОВ ЛЕПТОСПИР ДЛЯ РМА, РЕКОМЕНДУЕМЫЙ ДЛЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ НА ЛЕПТОСПИРОЗ В РЕСПУБЛИКЕ БЕЛАРУСЬ

-------------------------+--------------------+-----------------
¦       Серогруппа       ¦      Серовар       ¦   Эталонный штамм   ¦
+------------------------+--------------------+---------------------+
¦Icterohaemorrhagiae     ¦copenhageni         ¦M20                  ¦
+------------------------+--------------------+---------------------+
¦Javanica                ¦Poi                 ¦Poi                  ¦
+------------------------+--------------------+---------------------+
¦Javanica                ¦hanka               ¦Hanka <1>            ¦
+------------------------+--------------------+---------------------+
¦Canicola                ¦canicola            ¦Hond Utrecht IV      ¦
¦                        ¦                    ¦(Каширский) <2>      ¦
+------------------------+--------------------+---------------------+
¦Autumnalis              ¦autumnalis          ¦Akiyami A            ¦
+------------------------+--------------------+---------------------+
¦Australis               ¦australis           ¦Ballico              ¦
+------------------------+--------------------+---------------------+
¦Australis               ¦Erinacei europei    ¦Еж N 1               ¦
+------------------------+--------------------+---------------------+
¦Pomona                  ¦Pomona              ¦Pomona               ¦
+------------------------+--------------------+---------------------+
¦Pomona                  ¦mozdok              ¦П.О.5621             ¦
+------------------------+--------------------+---------------------+
¦Grippotyphosa           ¦grippotyphosa       ¦Moskva V             ¦
+------------------------+--------------------+---------------------+
¦Hebdomadis (Sejroe)     ¦saxkoebing          ¦Mus 24               ¦
+------------------------+--------------------+---------------------+
¦Hebdomadis (Sejroe)     ¦wolffi              ¦3705                 ¦
+------------------------+--------------------+---------------------+
¦Hebdomadis              ¦Hebdomadis          ¦Hebdomadis           ¦
+------------------------+--------------------+---------------------+
¦Hebdomadis              ¦kabura              ¦kabura               ¦
+------------------------+--------------------+---------------------+
¦Bataviae                ¦djatzi              ¦HS-26                ¦
+------------------------+--------------------+---------------------+
¦Tarassovi               ¦tarassovi           ¦Perepelicin          ¦
¦------------------------+--------------------+----------------------

Приложения:

<1> Циркуляция лептоспир серовара hanka установлена только в природных очагах Приморского края (Российская Федерация), поэтому соответствующий штамм рекомендован для включения в диагностическую панель только на этой территории.

<2> В скобках указан отечественный аналог.

Приложение 3
к Инструкции
о клинике, лечении,
лабораторной диагностике и
профилактике лептоспироза

МЕЖДУНАРОДНЫЙ НАБОР РЕФЕРЕНС-ШТАММОВ ЛЕПТОСПИР ДЛЯ ПОСТАНОВКИ РМА

----------------------+----------------------+-----------------
¦     Серогруппа      ¦       Серовар        ¦ Наименование штамма ¦
+---------------------+----------------------+---------------------+
¦          2          ¦          3           ¦          4          ¦
+---------------------+----------------------+---------------------+
¦Australis            ¦Australis             ¦Ballico              ¦
+---------------------+----------------------+---------------------+
¦Autumnalis           ¦autumnalis            ¦Akiyami A            ¦
+---------------------+----------------------+---------------------+
¦Ballum               ¦Castellonis           ¦Castellon 3          ¦
+---------------------+----------------------+---------------------+
¦Bataviae             ¦Bataviae              ¦Van Tienen           ¦
+---------------------+----------------------+---------------------+
¦Canicola             ¦canicola              ¦Hond Utrecht IV      ¦
+---------------------+----------------------+---------------------+
¦Celledoni            ¦Celledoni             ¦Celledoni            ¦
+---------------------+----------------------+---------------------+
¦Cynopteri            ¦Cynopteri             ¦3522C                ¦
+---------------------+----------------------+---------------------+
¦Djasiman             ¦Djasiman              ¦Djasiman             ¦
+---------------------+----------------------+---------------------+
¦Grippotyphosa        ¦grippotyphosa         ¦Moskva V             ¦
+---------------------+----------------------+---------------------+
¦Hebdomadis           ¦Hebdomadis            ¦Hebdomadis           ¦
+---------------------+----------------------+---------------------+
¦Icterohaemorrhagiae  ¦Copenhageni           ¦M20                  ¦
+---------------------+----------------------+---------------------+
¦Javanica             ¦Javanica              ¦Veldrat Bataviae 46  ¦
+---------------------+----------------------+---------------------+
¦Lousiana             ¦Lousiana              ¦LSU 1945             ¦
+---------------------+----------------------+---------------------+
¦Manhao               ¦Manhao4               ¦Lil30                ¦
+---------------------+----------------------+---------------------+
¦Mini                 ¦Mini                  ¦Sari                 ¦
+---------------------+----------------------+---------------------+
¦Panama               ¦Panama                ¦CZ214                ¦
+---------------------+----------------------+---------------------+
¦Pomona               ¦Pomona                ¦Pomona               ¦
+---------------------+----------------------+---------------------+
¦Pyrogenes            ¦Pyrogenes             ¦Salinem              ¦
+---------------------+----------------------+---------------------+
¦Ranarum              ¦Ranarum               ¦ICF                  ¦
+---------------------+----------------------+---------------------+
¦|Sarmin              ¦Sarmin                ¦Sarmin               ¦
+---------------------+----------------------+---------------------+
¦Sejroe               ¦Saхkoebing            ¦Mus 24               ¦
+---------------------+----------------------+---------------------+
¦                     ¦sejroe                ¦M84                  ¦
+---------------------+----------------------+---------------------+
¦                     ¦wolffi                ¦3705                 ¦
+---------------------+----------------------+---------------------+
¦Shermani             ¦Shermani              ¦1342K                ¦
+---------------------+----------------------+---------------------+
¦Tarassovi            ¦Tarassovi             ¦Perepelicin          ¦
¦---------------------+----------------------+----------------------

dokumenty archiwalne Папярэдні | Наступны