Постановление Министерства здравоохранения Республики Беларусь от 13.08.2008 № 130-А "Об утверждении Санитарных норм, правил и гигиенических нормативов "Гигиенические требования к безопасности парфюмерно-косметической продукции, ее производству и реализации"

Документ утратил силу

Стр. 11

Страницы: | Стр. 1 | Стр. 2 | Стр. 3 | Стр. 4 | Стр. 5 | Стр. 6 | Стр. 7 | Стр. 8 | Стр. 9 | Стр. 10 | Стр. 11

¦       ¦           +---------------------------------------------+-------+
¦       ¦           ¦Количество выделений увлажняет веки          ¦   3   ¦
¦       ¦           ¦и окружающие ткани                           ¦       ¦
¦-------+-----------+---------------------------------------------+--------

Индекс ирритативного действия испытуемой ПКП на слизистую глаза (Iir) в баллах равен среднему арифметическому суммы баллов интенсивности каждого из симптомов для каждого взятого в эксперименте животного.

Ирритативное действие на слизистые оболочки глаз у испытуемого образца ПКП отсутствует (условное обозначение Iir = 0 баллов), если значение индекса равно нулю.

3. Определение индекса острой пероральной токсичности.

По проявлениям гибели лабораторных животных и (или) симптоматики интоксикации при однократном пероральном введении определенной дозы испытуемых образцов средств по уходу за губами (губная помада, блеск, контурный карандаш и др.) судят о наличии острого токсического и раздражающего слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта действия изучаемой косметической продукции.

3.1. Лабораторные животные, аппаратура и реактивы.

В качестве лабораторных животных используют белых крыс массой 180 - 220 г. Требования по содержанию и подбору животных - аналогично 1.1.

При проведении испытания используют следующие материалы, аппаратуру и реактивы:

весы лабораторные общего назначения с метрологическими характеристиками по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г, 2-го класса точности или с аналогичными метрологическими характеристиками;

весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 0,1 - 10 кг, 4-го класса точности или с аналогичными метрологическими характеристиками;

шприцы медицинские по ГОСТ 8043 объемом 5 куб.см с ценой деления 0,1 см;

иглы-зонды для внутрижелудочного введения лабораторным животным;

цилиндры мерные по ГОСТ 1770 вместимостью 50 и 100 куб.см;

стаканчики стеклянные по ГОСТ 25336 вместимостью 100 куб.см;

вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

3.2. Подготовка к испытаниям.

На рычажных весах взвешивают лабораторных животных с точностью до 10 г, формируют однородные по массе (разница не более 10%), поведению и состоянию контрольную и опытную группы из не менее семи животных в каждой.

Из испытуемых образцов твердой и пастообразной консистенции готовят 50%-е водные суспензии или эмульсии, а эликсиры и жидкости для полоскания рта подготавливают согласно инструкции по их применению. Прочие жидкие средства применяют в нативном виде, а из спиртсодержащих готовят двойные объемные разведения в соотношении (1:1). В качестве растворителя используют дистиллированную воду.

3.3. Проведение испытаний.

Подготовленные к испытанию образцы ПКП шприцем с иглой-зондом по общепринятой в токсикологии методике вводят внутрижелудочно натощак животным опытной группы в определенном объеме (с точностью 0,1 куб.см), содержащем стандартную дозу нативного образца изделия из расчета 10 г на 1 кг веса каждого животного. Контрольным животным аналогично и в том же объеме вводят дистиллированную воду. Кормление животных допускается не ранее чем через 3 ч после введения.

Наблюдение за состоянием животных проводят ежедневно утром в течение 5 дней. Визуально контролируют и регистрируют количество и сроки гибели животных, клинические симптомы интоксикации (изменение поведения, внешнего вида, пище- и водопотребления, реакций на внешние раздражители, частоты дыхания, окраски ушей и конечностей; наличие мимических подергиваний и тремора конечностей, судорог, парезов, параличей, развитие наркотического или коматозного состояния и т.п.) и раздражение слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта (срыгивание, слюнотечение, изменение характера испражнений и т.п.).

При выявлении гибели животных и (или) установлении клинических симптомов интоксикации проводят вскрытие животных и макро-патоморфологические исследования основных органов, слизистой оболочки рта и желудочно-кишечного тракта с определением их состояния (наличие гиперемии, геморрагии, отечности, эрозий и т.д.) в сравнении с животными контрольной группы.

3.4. Экспертная оценка результатов.

Острая пероральная токсичность у испытуемого образца косметической продукции отсутствует и индекс оценивается как равный нулю (условное обозначение It.ac.o. = 0 баллов) при отсутствии гибели опытных животных и клинических симптомов интоксикации и раздражения слизистой желудочно-кишечного тракта, связанных с воздействием вводимого внутрижелудочно образца, в сравнении с контрольными животными. Испытуемый образец является токсичным при поступлении внутрь организма и опасным для здоровья, а индекс оценивается как равный 1,0 (условное обозначение It.ac.o. = 1 балл) при установлении причинной зависимости гибели и (или) симптоматики интоксикации опытных животных от введения испытуемого образца продукта в сравнении с контрольными животными.

4. Определение сенсибилизирующей способности.

Содержащиеся в ПКП высокомолекулярные соединения при контакте с кожей и слизистыми обычно не представляют реальной аллергоопасности. Однако многие низкомолекулярные косметические средства и ингредиенты ПКП (особенно красители, отдушки, стабилизаторы, бактерицидные и другие вещества) способны к трансдермальному проникновению и образованию (за счет активных химических детерминант) конъюгатов с аутобелками организма, что может индуцировать гиперчувствительность замедленного и (или) немедленного типов к этим веществам и содержащим их ПКП. Поэтому задачей настоящего испытания является оценка сенсибилизирующей способности и прогнозирование аллергоопасности изучаемых образцов ПКП при контакте с кожей.

Определение сенсибилизирующей способности выполняют на привлекаемых волонтерах постановкой эпикутанных аллергологических проб. Данный метод позволяет изучить и прогнозировать аллергоопасность одновременно нескольких испытуемых образцов. При данном варианте методики необходимо строгое соблюдение условий и требований безопасности проведения испытания: не допускается испытание косметической продукции, содержащей пероксид водорода, органические растворители и красители (средства для окраски, обесцвечивания, восстановления цвета, химической завивки и фиксации волос, ухода за ногтями и т.д.).

4.1. Объекты наблюдения, аппаратура и реактивы.

В испытаниях участвуют волонтеры в возрасте старше 18 лет, изъявившие желание участвовать в исследованиях и не имеющие противопоказаний по состоянию здоровья. Исследования выполняют при строгом соблюдении требований инструкций по безопасному проведению испытаний ПКП на волонтерах, обязательно разрабатываемых в испытательных лабораториях.

При проведении испытания используют следующие материалы, аппаратуру и реактивы:

дозаторы пипеточные типа ПЛ-1 или варипипетки на 20 - 200 и 200 - 1000 куб.мм;

часы бытового назначения;

линейка металлическая измерительная 0-100 мм с ценой деления 1 мм по ГОСТ 427;

стаканы химические по ГОСТ 25336 вместимостью 50 и 100 куб.см;

цилиндры мерные по ГОСТ 1770 вместимостью 10 и 50 куб.см;

ножницы;

шпатели стеклянные, глазные;

вода дистиллированная по ГОСТ 6709;

спирт этиловый ректификат по ГОСТ 5962, а также водный раствор с объемной долей спирта 20%;

ацетон по ГОСТ 2601;

мыло туалетное "Детское";

бинт медицинский;

вата медицинская;

полиэтиленовая пленка для пищевых продуктов;

лейкопластырь, не содержащий каучук и теребентин.

4.2. Подготовка к испытаниям.

Формируют группу волонтеров не менее пяти человек. Изготавливают четырехслойные марлевые тампоны размером 1 x 1 см, накладки из полиэтиленовой пленки размером 2 x 2 см.

Готовят дозы испытуемых косметических продуктов, взвешивая на лабораторных весах (допустимая погрешность 5%) по 0,05 г изделий вязкой консистенции (непосредственно на марлевых тампонах); по 0,1 г продукта твердой консистенции (в стаканчиках), из которых готовят 50%-е растворы, эмульсии или суспензии; из спиртсодержащих продуктов (парфюмерные изделия, лосьоны и др.) готовят двойные объемные водные разведения в соотношении 1:1; из моющих средств для тела и волос - 10%-е водные растворы. В качестве растворителя используют дистиллированную воду. Приготовленные растворы или жидкие ПКП дозируют по 0,05 куб.см на марлевые тампоны, размещенные на полиэтиленовых накладках.

4.3. Проведение испытаний.

Испытания проводят постановкой закрытой эпикутанной "лоскутной" пробы, которая включает первичную сенсибилизирующую и вторичную провокационную аппликации. Первичную аппликационную пробу выполняют наложением на кожу внутренней поверхности предплечья или плеча волонтера (после обработки этиловым спиртом) марлевого тампона с дозой испытуемого продукта, покрытого полиэтиленовой накладкой, фиксацией пробы к коже полосками лейкопластыря. Контрольную пробу с дистиллированной водой выполняют аналогично опытной. При отсутствии специального лейкопластыря пробы фиксируют бинтованием.

Первичную аппликацию через сутки снимают, смывают остатки вещества с кожи опытного и контрольного участков струей теплой воды с туалетным мылом или ватным тампоном с растворителем (20%-й этиловый спирт) и через 1 час регистрируют функциональное состояние кожи на месте аппликации (по эритематозной реакции).

При возникновении у волонтера в период аппликационной экспозиции негативных клинических симптомов раздражения (ощущение зуда, жжения, болезненности) даже слабой (переносимой) интенсивности со стороны опытного участка кожи пробу немедленно снимают. В этом случае, а также при определении на опытном участке кожи эритемы после первичной аппликации (при отсутствии таковой на контрольном) первичную аппликацию у конкретного волонтера повторяют на другом участке кожи, снизив концентрацию испытуемого продукта не менее чем в два раза. В случае появления в процессе и после завершения повторной первичной аппликации субъективных симптомов раздражения и (или) эритематозной реакции кожи только у одного волонтера (с повышенной чувствительностью к данному изделию) его исключают из дальнейших исследований. При регистрации негативных проявлений у двух и более лиц дальнейшие испытания не проводят и делают вывод о том, что он обладает раздражающим действием на кожу (условное обозначение Icut = 1 балл).

При отсутствии субъективных симптомов или объективных признаков раздражения после первичной аналогично рядом с предыдущей (на расстоянии не менее двух сантиметров) на "чистом" участке кожи ставят на сутки вторичную аппликацию с тем же продуктом, а также контрольную пробу с дистиллированной водой (на том же первичном участке кожи).

Возникновение хотя бы у одного волонтера в период проведения вторичной аппликации клинических симптомов зуда, жжения, болезненности, в том числе на кожных участках первичной аппликации, свидетельствует о развитии немедленного типа гиперчувствительности, опыт с испытуемым образцом немедленно прекращают, учитывают результаты по выраженности клинических симптомов и дальнейшие его испытания не проводят.

Через 1 (после обработки), 24 и 48 часов после суточной аппликационной экспозиции одновременно на участках вторичной и первичной аппликаций испытуемого изделия и контрольной пробы визуально регистрируют функциональное состояние кожи (интенсивность эритематозной реакции, наличие первичных высыпаний), а также учитывают негативные субъективные клинические симптомы (зуд, жжение, болезненность) и их выраженность.

4.4. Обработка и оценка результатов.

Регистрируемые объективные и субъективные симптомы гиперчувствительности после провокационной вторичной аппликации оценивают в баллах согласно таблице 4.1.

Индекс сенсибилизирующей способности каждого образца ПКП равен среднему арифметическому результатов определения разницы выраженности объективных и субъективных симптомов гиперчувствительности в баллах на опытном и контрольном участках кожи.

Сенсибилизирующая способность у испытуемого образца ПКП при контакте с кожей отсутствует (условное обозначение Is = 0 баллов), если значение индекса равно нулю.

Таблица 4.1

Оценка объективных и субъективных симптомов гиперчувствительности при контакте с кожей человека испытуемой ПКП

------------------------------------------------------------------+---
¦       Характеристика и выраженность кожных и субъективных       ¦Оценка,¦
¦                      клинических симптомов                      ¦ балл  ¦
+-----------------------------------------------------------------+-------+
¦Отсутствие видимых изменений кожи и субъективных симптомов       ¦   0   ¦
+-----------------------------------------------------------------+-------+
¦Слабая эритема (розовый тон) на участке вторичной аппликации     ¦   1   ¦
+-----------------------------------------------------------------+-------+
¦Слабая эритема (розовый тон) на участке первичной аппликации,    ¦   2   ¦
¦умеренно выраженная эритема (розово-красный тон) на участке      ¦       ¦
¦вторичной аппликации; слабые (переносимые) ощущения зуда, жжения,¦       ¦
¦болезненности на участках аппликаций                             ¦       ¦
+-----------------------------------------------------------------+-------+
¦Выраженная эритема (ярко-красный тон); первичные экссудативные   ¦   3   ¦
¦или пролиферативные высыпания; выраженные ощущения зуда, жжения, ¦       ¦
¦болезненности                                                    ¦       ¦
¦-----------------------------------------------------------------+--------

Приложение 9
к Санитарным нормам, правилам
и гигиеническим нормативам
"Гигиенические требования к безопасности
парфюмерно-косметической продукции,
ее производству и реализации"

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ БЕЗОПАСНОСТИ ПКП

1. Настоящее приложение обязательно для соблюдения лабораториями органов и учреждений, осуществляющих госсаннадзор за качеством и безопасностью производимой, реализуемой и применяемой ПКП, а также испытательными лабораториями, аттестованными Минздравом и аккредитованными на проведение микробиологических испытаний гигиенической безопасности косметической продукции.

2. Оборудование, материалы и питательные среды.

2.1. Оборудование:

                                                       НД (ГОСТ, ТУ)

Анализатор потенциометрический с погрешностью          ГОСТ 19881-74
измерений рН +/- 0,1 (рН-метр)

Аппарат для встряхивания жидкости в колбах             ТУ 64-1-2451-78
или пробирках

Баня водяная с терморегулятором, позволяющая           ГОСТ 12026-76
поддерживать температуру (45 +/- 0,5) °С

Весы лабораторные квадрантные 4-го класса точности     ГОСТ 24104-88Е
с наибольшим пределом взвешивания 500 г

Весы лабораторные 2-го класса точности с наибольшим    ГОСТ 24104-88Е
пределом взвешивания 200 г

Дистиллятор электрический

Лупа с пятикратным увеличением                         ГОСТ 25706-83

Микроскоп световой биологический с увеличением         ГОСТ 8284-78

          x
900 - 1000

Прибор вакуумного фильтрования

Прибор для счета колоний бактерий ПСБ                  ТУ 64-1-2041-72

Стерилизаторы паровые медицинские или аналогичные      ГОСТ 19569-89

Стерилизатор сухожаровой с автоматической              ГОСТ 24437-89
регулировкой температуры (100 - 220) °С

Термометр (0 - 100) °С, цена деления 1 °С              ГОСТ 24498-90

Термостаты электрические суховоздушные                 ТУ 64-1-1382-72
с автоматическим терморегулятором до 50 °С,
позволяющие поддерживать заданную температуру
с погрешностью +/-1 °С

Холодильник бытовой                                    ГОСТ 16317-87

Электроплитка бытовая                                  ГОСТ 14919-83

2.2. Материалы:

Бумага индикаторная универсальная                      ТУ 6-091181-76

Бумага фильтровальная лабораторная                     ГОСТ 12026-76

Вата медицинская гигроскопичная                        ГОСТ 5556-81

Картон для предварительной фильтрации марки КФБЖ       ТУ 13-7308000-691-84

Картон для предварительной фильтрации марки КФМП       ТУ 13-7308001-673-84

Марля медицинская                                      ГОСТ 9412-93

Колбы плоскодонные конические или круглые разной       ГОСТ 25336-82
вместимости

Ножницы                                                ГОСТ 21241-89

Петли бактериологические

Пипетки разной вместимости 2-го класса точности        ГОСТ 20292-74

Пробирки бактериологические типов П1 и П2              ГОСТ 25336-82

Спиртовки лабораторные стеклянные                      ГОСТ 23932-90 Е

Стекла предметные                                      ГОСТ 9284-75

Стекла покровные                                       ГОСТ 6672-75

Ступки фарфоровые                                      ГОСТ 9147-80

Цилиндры на 100 - 250 куб.см                           ГОСТ 1770-74

Флаконы стеклянные градуированные вместимостью         ГОСТ 10782-85
100, 200, 500 куб.см

Фильтры мембранные типа МФАС-Б5 или МФА-МА-N5,         ТУ 6-05-1903-81
диаметр 47 мм, размер пор 0,45 мкм

Фильтры мембранные типа HAWG (Millipore),
диаметр 47 мм, размер пор 0,45 мкм

Фильтры мембранные типа АР 15 (Millipore),
диаметр 47 мм

Стандарт титры для приготовления образцовых буферных   ГОСТ 8.135-2004 ГСИ
растворов для рН-метрии

Штативы для пробирок

Шпатели стеклянные

Чашки Петри 90 - 100 мм                                ГОСТ 25336-82

2.3. Питательные среды и реактивы:

Агар микробиологический в порошке или волокнах         ГОСТ 17206-96

Агар сухой питательный для культивирования             ФС 42-188ВС-90
микроорганизмов

Агар Эндо                                              ФС 42-186ВС-88

Бульон мясопептонный                                   ГОСТ 10444.1-84

Бромкрезоловый пурпурный (индикатор)                   ГФ РБ Т.1

Вода дистиллированная                                  ГОСТ 6709-72

Вода мясная                                            ГОСТ 10444.1-84

Гидролизат казеина панкреатический

Глюкоза                                                ГОСТ 6038-79

Глицерин                                               ГОСТ 6824-96

Желчь сухая медицинская                                ГОСТ 49278-75

Калий сернокислый                                      ГОСТ 4145-74

Калия нитрат                                           ГОСТ 4217-77

Калий фосфорнокислый однозамещенный                    ГОСТ 4198-75

Калий фосфорнокислый двузамещенный                     ГОСТ 2493-75

Калия теллурит, раствор с массовой концентрацией 2%

Кислота соляная, раствор с массовой концентрацией      ГОСТ 3118-77
0,1 моль/куб.дм

Кислота сульфаниловая                                  ГОСТ 5281-78

Кислота тиогликолевая

Кислота уксусная ледяная                               ГОСТ 61-75

Кислота карболовая (фенол)                             ГОСТ 6417-72

Литий хлористый, 6-водный                              ГОСТ 4328-77

Магний хлористый                                       ГОСТ 4209-77

Малахитовый зеленый, индикатор                         ГФ РБ Т.1

Маннит                                                 ГОСТ 8321-74

Мальтоза

Масло вазелиновое медицинское                          ГОСТ 3164-78

Масло иммерсионное                                     ГОСТ 13739-78

Метиленовый синий

Натрия гидроокись, раствор с массовой концентрацией    ГОСТ 4238-77
0,1 моль/куб.дм

Натрия резазурин, раствор массовой концентрацией
1,0 г/куб.дм

Натрий сернистокислый, раствор с массовой              ТУ 6-09-5313-86
концентрацией 1,0 г/куб.дм

Натрия тиогликолят

Натрий хлористый                                       ГОСТ 4233-77

Натрий фосфорнокислый однозамещенный                   ГОСТ 245-76

Натрий фосфорнокислый двузамещенный                    ГОСТ 4172-76

N,N-диметил-n-фенилендиамин дигидрохлорид, раствор
массовой концентрации 1%

Основа бактериологическая питательных сред сухая       ФС 42-3407-97
(Бактофок-МК)

1-Нафтиламин                                           ГОСТ 8827-79

1-Нафтол, спиртовой раствор                            ГОСТ 5838-79

Пептон сухой ферментативный                            ГОСТ 13805-76

Питательная среда N 1 (для культивирования аэробных    ВФС 42-1801-88
и факультативно-анаэробных микроорганизмов), сухая

Питательная среда N 2 (для выращивания грибов),        ВФС 42-1802-88
сухая

Питательная среда N 3 (для обогащения бактерий         ВФС 42-1803-88
семейства Enterobacteriaceae), сухая

Питательная среда N 6 (для определения ферментации     ВФС 42-2038-91
глюкозы)

Питательная среда N 7 (для определения                 ВФС 42-2020-90
восстановления нитратов в нитриты)

Питательная среда N 8 (для выращивания P. aeruginosa   ВФС 42-3181-95
и S. aureus), сухая

Питательная среда N 9 (для выявления пигмента          ВФС 42-1909-89
пиоцианина P. aeruginosa), сухая

Питательная среда N 10 (для идентификации S.           ВФС 42-1908-89
aureus), сухая

Питательная среда для контроля стерильности, сухая     ВФС 42-3390-97

Плазма кролика, сухая цитратная, для реакции
плазмокоагуляции

Растворы и реактивы для окраски мазков по Граму        ГОСТ 10444.1-84;
                                                       ГОСТ 18963-73

Реактив Грисса

Спирт этиловый ректификованный                         ГОСТ 5962-67

Спирт этиловый ректификованный технический             ГОСТ 18300-87

Твин-80

Феноловый красный, индикатор                           ГФ РБ Т.1

Цистин (цистеин)

2.4. Штаммы микроорганизмов:

Штамм Staphylococcus aureus, обладающий ферментом
коагулазой, полученный из государственных коллекций

Допускается применение оборудования и материалов с аналогичными по назначению техническими и метрологическими характеристиками, а также использование других коммерческих питательных сред и диагностических препаратов аналогичного назначения для проведения исследований в соответствии с данным документом. При их применении следует руководствоваться рекомендациями изготовителя. Питательные среды и биологические препараты импортного производства должны иметь международный сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000, питательные среды и препараты отечественного производства должны вырабатываться по ТНПА, утвержденным в установленном порядке.

3. Подготовка к микробиологическому анализу.

3.1. Подготовку и стерилизацию посуды для микробиологического анализа производят согласно требованиям СТБ ГОСТ Р 51446-2001 "Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований".

3.2. При взвешивании компонентов сред и испытуемых образцов парфюмерно-косметических изделий допускается погрешность 0,1%.

3.3. Для приготовления растворов реактивов и питательных сред используют дистиллированную воду, если нет специальных указаний, и реактивы квалификации "х.ч." или "ч.д.а.".

3.4. Необходимое значение водородного показателя рН (далее - рН) растворов и питательных сред устанавливают с помощью раствора гидроокиси натрия массовой концентрации 0,1 моль/куб.дм или раствора кислоты соляной объемной долей 0,1 моль/куб.дм. рН растворов и питательных сред определяют с помощью рН-метра. Ориентировочное определение рН растворов и питательных сред допускается проводить с помощью индикаторной бумаги.

4. Приготовление растворов реактивов.

4.1. Изотонический 0,85%-й раствор хлористого натрия (физиологический раствор).

0,85 г хлористого натрия растворяют в 100 куб.см дистиллированной воды и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °С в течение 15 мин.

Хранят при комнатной температуре не более 14 сут.

4.2. 1%-й раствор твина-80.

1,0 г твина-80 растворяют в 99 куб.см физиологического раствора, фильтруют через ватно-марлевый фильтр и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °С в течение 15 мин.

Хранят при комнатной температуре не более 14 сут.

4.3. 4%-й раствор твина-80.

4,0 г твина-80 растворяют в 96 куб.см физиологического раствора, фильтруют через ватно-марлевый фильтр и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °С в течение 15 мин.

Хранят при комнатной температуре не более 14 сут.

4.4. Раствор фенолового красного массовой концентрации 1%.

0,1 г фенолового красного растирают в ступке, добавляя небольшими порциями 2,82 куб.см 0,1 М раствора натрия гидроокиси и 20 мл 96%-го спирта. Раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб.см и доводят водой до метки.

Хранят во флаконе из темного стекла в холодильнике при температуре (+4 - 10) °С в течение 7 суток.

4.5. Раствор малахитового зеленого массовой концентрации 0,5%.

0,5 г малахитового зеленого помещают в стерильный флакон, заливают 100 куб.см горячей дистиллированной воды и помещают на 24 ч в термостат с температурой (37 +/- 1) °С, периодически перемешивая.

Хранят во флаконе из темного стекла в холодильнике при температуре (+4 - 10) °С в течение 7 - 10 суток.

4.6. Приготовление реактива Грисса.

Во флакон со 100 куб.см водного раствора кислоты уксусной с массовой долей 12% вносят 10,0 г сухого реактива Грисса, растворяют при перемешивании.

При отсутствии сухого реактива Грисса его готовят следующим образом:

раствор N 1: 0,5 г кислоты сульфаниловой растворяют в 30 куб.см ледяной уксусной кислоты, прибавляют 100 куб.см воды дистиллированной, фильтруют через бумажный фильтр. Раствор годен в течение месяца;

раствор N 2: 0,1 г 1-нафтиламина растворяют в 100 куб.см кипящей дистиллированной воды, охлаждают, прибавляют 30 куб.см ледяной уксусной кислоты, фильтруют через бумажный фильтр. Раствор годен в течение 7 суток.

Перед применением смешивают равные объемы растворов N 1 и N 2.

4.7. Реактив для определения наличия фермента цитохромоксидазы.

Раствор N 1. 1,0 г 1-нафтола растворяют в 100 куб.см спирта этилового.

Раствор N 2. 1,0 г N,N-диметил-п-фенилендиамин дигидрохлорида растворяют в 100 куб.см дистиллированной воды.

Перед применением смешивают растворы N 1 и N 2 в соотношении 2:3.

Хранят во флаконах из нейтрального светозащитного стекла при температуре (+4 - 10) °С в течение 14 сут.

5. Приготовление питательных сред.

5.1. Среды для культивирования аэробных и факультативно-анаэробных бактерий.

5.1.1. Мясопептонный агар с глюкозой.

В колбу с 1 куб.дм мясопептонного бульона (далее - МПБ) вносят 10,0 г пептона, 5,0 г натрия хлорида, 1,0 г глюкозы. Все ингредиенты растворяют, прибавляют 13,0 г агара микробиологического, нагревают смесь на электроплитке до полного растворения агара при перемешивании, фильтруют в горячем виде через воронку с ватно-марлевым или бумажным фильтром, устанавливают рН (7,3 +/- 0,1), разливают во флаконы и стерилизуют при температуре (121 +/- 1)°С в течение 20 мин.

Хранят при температуре (+4 - 10) °С не более 1 месяца.

Вместо МПБ можно использовать перевар Хоттингера с концентрацией аминного азота не менее 100 мг/куб.дм.

5.1.2. Питательный агар "МК" с глюкозой.

В колбе с 1 куб.дм воды дистиллированной растворяют 20,0 г Бактофока-МК, 5,0 г натрия хлорида, 1,0 г глюкозы, прибавляют 13,0 г агара микробиологического, нагревают смесь на электроплитке до полного растворения агара при перемешивании, фильтруют в горячем виде через воронку с ватно-марлевым или бумажным фильтром, устанавливают рН (7,3 +/- 0,1), разливают во флаконы и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °С в течение 20 мин.

Хранят при температуре (+4 - 10) °С не более 1 месяца.

Допускается использовать агар сухой питательный для культивирования микроорганизмов или питательную среду N 1 сухую.

5.2. Среды для выращивания плесневых грибов и дрожжей (Сабуро).

5.2.1. Среда для выращивания плесневых грибов и дрожжей (Сабуро).

В колбу с 1 куб.дм дистиллированной воды вносят 10,0 г пептона ферментативного сухого или Бактофока-МК, 40,0 г глюкозы или мальтозы, прибавляют 13,0 г агара микробиологического, нагревают смесь на электроплитке до полного растворения всех компонентов при перемешивании, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают рН (5,8 +/- 0,2), разливают во флаконы и стерилизуют при температуре (112 +/- 1) °С в течение 20 мин.

Хранят при температуре (+4 - 10) °С не более 1 месяца.

Допускается использовать питательную среду N 2 сухую.

5.2.2. Среда Сабуро жидкая.

В колбу с 1 куб.дм дистиллированной воды вносят 10,0 г пептона ферментативного сухого или Бактофока-МК, 40,0 г глюкозы или мальтозы, нагревают смесь на электроплитке до полного растворения всех компонентов при перемешивании, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают рН (5,8 +/- 0,2), разливают во флаконы и стерилизуют при температуре (112 +/- 1) °С в течение 20 мин.

Хранят при температуре (+4 - 10) °С не более 14 сут.

5.3. Среды обогащения для бактерий семейства Enterobacteriaceae.

5.3.1. Среда для выращивания бактерий семейства Enterobacteriaceae.

В колбу с 1 куб.дм воды дистиллированной вносят 20,0 г пептона сухого ферментативного или Бактофока-МК, 7,5 г натрия фосфат двузамещенного, 2,5 г калия фосфат однозамещенного. Смесь перемешивают при нагревании до полного растворения солей, вносят 10,0 г глюкозы, прибавляют 8 куб.см 1%-го водного раствора фенолового красного и 3 куб.см 0,5%-го водного раствора малахитового зеленого, устанавливают рН (7,5 +/- 0,1), нагревают до полного растворения компонентов, фильтруют через бумажный фильтр, разливают во флаконы по 100 куб.см и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °С в течение 20 мин.

Хранят при температуре (+4 - 10) °С не более 14 сут.

5.3.2. Среда Мак-Конки.

В колбу с 1 куб.дм воды дистиллированной вносят 20,0 г пептона сухого ферментативного или Бактофока-МК, 10,0 г лактозы, 5,0 г желчи сухой, 0,01 г бромкрезолового пурпурного. Все ингредиенты растворяют в воде, нагревают до полного растворения компонентов, устанавливают рН (7,5 +/- 0,1), фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают во флаконы по 100 куб.см и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °С в течение 20 мин.

Хранят при температуре (+4 - 10) °С не более 14 сут.

Допускается использовать среду N 3 сухую.

5.4. Питательные среды для идентификации бактерий семейства Enterobacteriaceae.

5.4.1. Агар Эндо.

Готовят из среды Эндо сухой по указанию (прописи) на этикетке. Хранят при температуре (+4 - 10) °С не более 5 сут.

5.4.2. Среда для определения ферментации глюкозы.

В колбу с 1 куб.дм дистиллированной воды вносят 10,0 г пептона ферментативного сухого или Бактофока-МК, 5,0 г хлорида натрия, растворяют при нагревании, вносят 40,0 г глюкозы, прибавляют 8 куб.см 1%-го водного раствора фенолового красного, устанавливают рН (7,4 +/- 0,2), кипятят на электроплитке в течение 1 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в пробирки с поплавками по (4 - 5) куб.см и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °С в течение 20 мин. По окончании стерилизации среду как можно скорее охлаждают.

Хранят при температуре (+4 - 10) °С не более 14 сут.

Допускается использовать среду N 6 сухую.

5.4.3. Среда для определения восстановления нитратов в нитриты.

В колбу с 1 куб.дм дистиллированной воды вносят 5,0 г пептона ферментативного сухого или Бактофока-МК, 5,0 г натрия хлорида, 1,5 г калия нитрата, растворяют при перемешивании и нагревании, устанавливают рН (7,2 +/- 0,2), кипятят на электроплитке в течение 1 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в пробирки по (4 - 5) куб.см и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °С в течение 20 мин.

Хранят при температуре (+4 - 10) °C не более 14 сут.

Допускается использовать среду N 7 сухую.

5.4.4. Среда Хью-Лейфсена.

В колбу с 1 куб.дм дистиллированной воды вносят 2,0 г пептона ферментативного сухого или Бактофока-МК, 10,0 г глюкозы, 5,0 г натрия хлорида, 0,3 г калия фосфорнокислого двузамещенного, добавляют 3,0 г агара микробиологического, растворяют при перемешивании и нагревании, кипятят на электроплитке в течение 2 - 3 мин, устанавливают рН (7,4 +/- 0,1), фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в пробирки по 10 - 15 куб.см и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 20 мин.

Цвет среды до автоклавирования - синий, после - травянисто-зеленый.

Хранят при температуре (+4 - 10) °C не более 14 сут.

5.5. Среды для обогащения бактерий вида Pseudomonas aeruginosa.

5.5.1. Мясопептонный бульон с глюкозой.

В колбу с 1 куб.дм мясной воды вносят 10,0 г пептона ферментативного сухого, 5,0 г натрия хлорида, 1,0 г глюкозы, растворяют при перемешивании и нагревании, устанавливают рН (7,3 +/- 0,2), фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают во флаконы по 100 куб.см и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °С в течение 20 мин.

Хранят при температуре (+4 - 10) °С не более 14 сут.

5.5.2. Питательный бульон "МК" с глюкозой.

В колбу с 1 куб.дм дистиллированной воды вносят 10,0 г Бактофока-МК, 1,0 г глюкозы, 5,0 г натрия хлорида. Все ингредиенты растворяют при перемешивании и нагревании, устанавливают рН (7,3 +/- 0,2), фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают во флаконы по 100 куб.см и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °С в течение 20 мин.

Хранят при температуре (+4 - 10) °С не более 14 сут.

5.5.3. Среда для обогащения бактерий вида Pseudomonas aeruginosa.

В колбу с 1 куб.дм дистиллированной воды вносят 10,0 г пептона ферментативного сухого или Бактофока-МК, 5,0 г натрия хлорида, 2,5 г калия фосфорнокислого двузамещенного, растворяют при перемешивании и нагревании, вносят 2,5 г глюкозы, устанавливают рН (7,3 +/- 0,2), кипятят на электроплитке в течение 1 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают во флаконы по 100 куб.см и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °С в течение 20 мин.

Хранят при температуре (+4 - 10) °С не более 14 сут.

Допускается использовать среду N 8 сухую.

5.6. Среда для выявления пигмента пиоцианина (Среда Кинг-А).

В колбу с 1 куб.дм дистиллированной воды вносят 20,0 г пептона ферментативного сухого или Бактофока-МК, 5,0 г магния хлорида безводного, 1,0 г калия сульфата безводного. Все ингредиенты растворяют в воде и оставляют на 15 мин. Затем вносят 10,0 куб.см глицерина, тщательно перемешивают, растворяют при нагревании, устанавливают рН (7,2 +/- 0,2), кипятят на электроплитке в течение 1 мин, прибавляют агар микробиологический, нагревают до полного его расплавления, фильтруют через ватно-марлевый фильтр и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °С в течение 20 мин.

Хранят при температуре (+4 - 10) °С не более 14 сут.

Допускается использовать среду N 9 сухую.

5.7. Среды для обогащения бактерий вида Staphylococcus aureus.

5.7.1. Солевой бульон.

В колбу со 100 куб.см мясопептонного бульона вносят 6,0 г хлорида натрия, устанавливают рН (6,9 +/- 0,1), разливают во флаконы и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °С в течение 20 мин.

Хранят при температуре (+4 - 10) °С не более 14 сут.

5.7.2. Среда, приготовленная по 5.5.3.

Допускается использовать среду N 8 сухую.

5.8. Среды для идентификации бактерий вида Staphylococcus aureus.

5.8.1. Желточно-солевой агар.

Эмульсия яично-желточная: куриное яйцо протирают ватой, смоченной этиловым спиртом, помещают в стерильную чашку Петри, стерильным инструментом пробивают с противоположных сторон яйца два отверстия. Через одно отверстие полностью удаляют белок, затем, увеличив отверстие, выливают желток в стерильную колбу с 50 куб.см физиологического раствора, содержимое встряхивают до однородной массы.

Хранят при температуре (+4 - 10) °С не более 72 ч.

1 куб.дм мясопептонного агара перед анализом расплавляют и растворяют в нем 95,0 г хлористого натрия, охлаждают до температуры (45 +/- 1) °С и добавляют 100 куб.см яично-желточной эмульсии. Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.

Хранят при температуре (+4 - 10) °С не более 5 сут.

5.8.2. Агар Байрд-Паркер.

В 1 куб.дм одной из питательных сред, приготовленных по подпункту 5.5.1 или подпункту 5.5.2, вносят 17,9 г лития хлорида, 15 г агара микробиологического в волокнах или порошке, 5,0 г мясного экстракта и 5,0 куб.см экстракта дрожжевого, перемешивают и нагревают до полного растворения компонентов. Охлаждают до 50 - 60 °С, устанавливают рН (6,9 +/- 0,1), разливают во флаконы по 100 куб.см и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °С в течение 20 мин.

К 90 куб.см основы среды добавляют асептически 5,0 куб.см желточной эмульсии и стерилизованные фильтрованием через мембранный фильтр растворы: 6,3 куб.см раствора глицина концентрации 200 г/куб.дм, 5,0 куб.см раствора пирувата натрия концентрации 200 г/куб.дм и 1,0 куб.см раствора теллурита калия концентрации 10 г/куб.дм.

Хранят при температуре (+4 - 10) °С не более 48 часов.

5.8.3. Маннитно-солевой агар.

В колбу с 1 куб.дм дистиллированной воды вносят 10,0 г пептона ферментативного сухого или Бактофока-МК, 75,0 г натрия хлорида безводного, 10,0 г маннита. Все ингредиенты растворяют в воде, затем вносят 2,5 куб.см 1%-го раствора фенолового красного, тщательно перемешивают, устанавливают рН (7,6 +/- 0,2), кипятят на электроплитке в течение 1 мин, прибавляют агар микробиологический, нагревают до полного его расплавления, фильтруют через ватно-марлевый фильтр и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °С в течение 15 мин.

Хранят при температуре (+4 - 10) °С не более 14 сут.

Допускается использовать среду N 10 сухую (для идентификации стафилококков).

5.8.4. Среда Гисса с маннитом и мальтозой.

В колбу с 1 куб.дм дистиллированной воды вносят 10,0 г пептона ферментативного сухого или Бактофока-МК, 5,0 г натрия хлорида безводного, 10,0 г маннита или мальтозы. Все ингредиенты растворяют в воде, затем вносят 2,5 куб.см 1%-го раствора фенолового красного, тщательно перемешивают, устанавливают рН (7,6 +/- 0,2), кипятят на электроплитке в течение 1 мин, прибавляют заранее замоченный агар микробиологический, нагревают до полного его расплавления, фильтруют через ватно-марлевый фильтр и стерилизуют при температуре (115 +/- 1) °С в течение 15 мин.

Хранят при температуре (+4 - 10) °С не более 14 сут.

5.9. Среда для контроля стерильности (тиогликолевая).

Среду готовят в соответствии с указаниями на этикетке или по следующей прописи.

В колбу с 1 куб.дм дистиллированной воды вносят 15,0 г панкреатического гидролизата казеина, 5,0 г дрожжевого экстракта, 2,5 г натрия хлорида, 5,0 г глюкозы, 0,75 г цистина (цистеина), 0,5 г тиогликолевой кислоты или тиогликолята натрия, 1 куб.см раствора резазурина натрия 1:1000. Все ингредиенты растворяют в воде, прибавляют замоченный заранее агар микробиологический, нагревают до полного растворения всех компонентов, устанавливают рН (7,2 +/- 0,2), фильтруют через ватно-марлевый фильтр и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °С в течение 15 мин.

Хранят при температуре (10 - 25) °С в защищенном от света месте в течение 7 сут.

6. Отбор проб для микробиологического анализа.

6.1. При отборе проб следует руководствоваться требованиями действующих ТНПА.

6.2. Пробы парфюмерно-косметических изделий для микробиологического анализа отбирают до отбора проб для физико-химических, органолептических и других видов испытаний с соблюдением правил асептики, чтобы исключить вторичное загрязнение продукта.

6.3. При испытаниях на стерильность от каждой партии парфюмерно-косметических изделий, независимо от ее объема, отбирают 10 ампул.

6.4. Пробу, отобранную от отдельной единицы упаковки, называют разовой. Количество продукта в разовых пробах из каждой единичной упаковки должно быть одинаковым. Разовые пробы соединяют, перемешивают и составляют среднюю пробу.

7. Подготовка проб для определения микробиологической чистоты парфюмерно-косметической продукции.

7.1. Для подготовки к анализу следует использовать образцы испытуемых парфюмерно-косметических изделий с ненарушенной упаковкой и не подвергавшихся внешнему воздействию.

Перед вскрытием упаковки место соединения крышки с тарой обрабатывают 70%-м раствором этилового спирта. Первую порцию в количестве примерно 10% содержимого упаковки отбрасывают, затем отбирают пробы и переносят в стерильную колбу или флакон вместимостью (100 - 200) куб.см.

7.2. Для испытания готовят среднюю пробу не менее 10 г (куб.см). При получении неудовлетворительных результатов анализа хотя бы по одному из микробиологических показателей проводят повторный анализ удвоенного объема выборки.

В случае если масса (объем) парфюмерно-косметического средства в единичной упаковке менее 10 г (куб.см), содержимое исследуют полностью или используют большее количество упаковок.

7.3. (10,0 +/- 0,1) г (куб.см) средней пробы отбирают с соблюдением правил асептики и помещают в стеклянные колбы или флаконы, содержащие (90 +/- 1) куб.см 1%-го раствора твина-80 в физиологическом растворе (по подпункту 4.2). Смесь тщательно перемешивают до полной гомогенизации. При необходимости пробы нагревают на водяной бане или в термостате до (40 - 45) °С, но не более 10 мин. Для гомогенизации продукции, плохо растворимой в воде, используют стеклянные бусы.

Эмульсии типа вода - масло подготавливают аналогичным способом, используя 4%-й раствор твина-80 в физиологическом растворе (по подпункту 4.3) и предварительно (до встряхивания) прогревая на водяной бане или в термостате до (40 - 45) °С в течение 20 мин.

     Получают   смесь,   в  10  куб.см  которой  содержится  1  г  (куб.см)

                                                                       -1
парфюмерно-косметического   средства   -  первое  разведение  1:10  (10  ).
1 куб.см  материала  из  первого разведения переносят в пробирку с 9 куб.см
стерильного   физиологического   раствора,  перемешивают  новой  стерильной

                                                   -2
пипеткой  и  получают  второе  разведение 1:100 (10  ). 1 куб.см из второго
разведения   переносят   в   следующую  пробирку  с  9  куб.см  стерильного
физиологического   раствора,   перемешивают  новой  стерильной  пипеткой  и

                                        -3
получают  третье  разведение  1:1000 (10  ) и т.д. В результате исследуемая

                                              -2           -3
продукция  оказывается  разведенной  в 100 (10  ), 1000 (10  ) и более раз.
Полученные разведения используют для посевов.

Допускается производить посев жидких форм парфюмерно-косметической продукции в нативном виде в необходимых для анализа количествах.

7.4. Анализ подготовленных образцов должен быть выполнен в течение 30 мин. При невозможности выполнения этого условия анализ допускается проводить не позже чем через 3 часа после подготовки проб, сохраняя их в холодильнике при (+4 - 10) °С.

8. Подготовка проб к анализу на стерильность парфюмерно-косметической продукции.

8.1. Перед вскрытием ампулы с парфюмерно-косметической продукцией обрабатываются этиловым спиртом. Шейку ампулы осторожно прогревают в пламени горелки. На хорошо прогретую шейку ампулы капают 1 каплю стерильного физиологического раствора (по подпункту 4.1). Ампулы осторожно вскрывают по месту образовавшейся в стекле трещины.

8.2. Содержимое 10 ампул или 10 других упаковок объединяют в единую пробу. Из объединенной пробы отбирают стерильно (10,0 +/- 0,1) г (куб.см) парфюмерно-косметического средства.

При испытаниях методом прямого посева отобранные пробы непосредственно засевают в соответствующие питательные среды.

При испытаниях методом мембранных фильтров отобранные пробы помещают в стеклянные колбы или флаконы, содержащие (90 +/- 1) куб.см 1%-го раствора твина-80 в физиологическом растворе, пропущенного через мембранный фильтр с размером пор (0,45 +/- 0,02) мкм. Пробы тщательно перемешивают в течение 15 - 20 мин до полной гомогенизации.

При испытаниях масляных растворов пробы подготавливают аналогичным способом, используя 4%-й раствор твина-80 в физиологическом растворе, предварительно (до встряхивания) прогревая на водяной бане или в термостате до (40 - 45) °С в течение 20 мин.

10. При определении микробиологической чистоты парфюмерно-косметической продукции используют стандартизированные методы микробиологического посева. Определяют следующие группы микроорганизмов: мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы, плесневые грибы и дрожжи, бактерии семейства Enterobacteriaceae, бактерии вида Staphylococcus aureus, бактерии вида Pseudomonas aeruginosa.

В микробиологических лабораториях, осуществляющих контроль качества и безопасности парфюмерно-косметической продукции, допускается применение импедансных методов для проведения исследований с использованием микробиологических анализаторов в соответствии с нормативными документами, утвержденными в установленном порядке.

11. Определение общего количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (МАФАнМ).

11.1. Сущность метода.

Метод основан на выявлении и количественном подсчете всех выросших колоний микроорганизмов при культивировании посевов в аэробных условиях при температуре (30 +/- 1) °С в течение (72 +/- 3) часов и в последующем пересчете их количества на 1 г (куб.см) исследуемого продукта.

11.2. Проведение анализа.

11.2.1. Метод глубинного посева.

Исследуемый материал в количестве 1 куб.см из соответствующего разведения (или 1 куб.см нативного продукта в жидкой форме) вносят стерильной пипеткой в две параллельные чашки Петри и не позже чем через 15 мин заливают расплавленной и охлажденной до (45 +/- 1) °С одной из сред по подпункту 5.1 в количестве (10 - 15) куб.см. Быстро перемешивают, аккуратно вращая чашку по поверхности стола.

После застывания среды чашки с посевами помещают в термостат вверх дном и инкубируют при температуре (30 +/- 1) °С в течение (72 +/- 3) часов.

11.2.2. Двухслойный агаровый метод.

Исследуемый материал в количестве 1 куб.см из соответствующего разведения (или 1 куб.см нативного продукта в жидкой форме) вносят стерильной пипеткой в две пробирки с 4 куб.см одной из сред по подпункту 5.1, предварительно расплавленной и охлажденной до температуры (45 +/- 1) °С. Быстро перемешивают содержимое пробирок и переносят в две параллельные чашки Петри с застывшей средой по подпункту 5.1, распределяя его равномерно по поверхности среды.

После застывания чашки перемещают в термостат вверх дном и термостатируют при температуре (30 +/- 1) °С в течение (72 +/- 3) часов.

11.3. Обработка и выражение результатов.

Результаты оцениваются по каждой пробе отдельно.

Для количественного подсчета отбирают чашки, на которых выросло от 15 до 300 колоний микроорганизмов, колонии суммируют и вычисляют среднее арифметическое значение из посевов одного разведения.

Допускается учитывать колонии с помощью лупы с пятикратным увеличением.

Полученное среднее арифметическое число колоний округляют следующим образом:

если число меньше 100, его округляют до ближайшего числа, кратного 5;

если число больше 100 и его последняя цифра 5, его округляют до ближайшего числа, кратного 20;

если число больше 100 и его последняя цифра не 5, его округляют до ближайшего числа, кратного 10.

Общее количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов Х вычисляют по формуле

                                         N
                                   a x 10
                               X = -------,
                                      q

где a - округленное среднее арифметическое число колоний;
    q - объем посевного материала, внесенного в чашки, куб.см;
    N - степень десятикратного разведения образца продукта.

                                                                 N
     Результаты  анализа  выражают  числом  (от  1,0 до 9,9) x 10 , где N -
соответствующая степень десятикратного разведения продукта.
     Если  среднеарифметическое  значение числа колоний, выросших на чашках
Петри,  в  посевах  одного  разведения  меньше  15,  то результаты выражают
следующим образом:

                                                          N
                                                        10
количество  микроорганизмов  меньше  15  умножают  на   --- КОЕ/г (куб.см).
                                                         q

     Если на чашках с разведением 1:10 не обнаружено роста микроорганизмов,

                                                        1
то результаты выражают следующим образом: менее 1,0 x 10  КОЕ/г (куб.см).

Если на чашках выросло более 300 колоний, то учитывают результаты на чашках с последующим разведением.

12. Определение общего количества плесневых грибов и дрожжей.

12.1. Сущность метода.

Метод основан на выявлении и количественном подсчете всех выросших колоний микроорганизмов, типичных по макро- и (или) микроскопической морфологии, на селективной агаризованной питательной среде Сабуро при культивировании посевов при температуре (24 +/- 1) °С в течение (120 +/- 3) часов и в последующем пересчете их количества на 1 г (куб.см) исследуемого продукта.

12.2. Проведение анализа.

12.2.1. Метод глубинного посева.

Исследуемый материал в количестве 1 куб.см из соответствующего разведения (или 1 куб.см нативного продукта в жидкой форме) вносят стерильной пипеткой в две параллельные чашки Петри и не позже чем через 15 мин заливают расплавленной и охлажденной до (45 +/- 1) °С средой Сабуро по подпункту 5.2.1 в количестве (10 - 15) куб.см. Быстро перемешивают, аккуратно вращая чашку по поверхности стола.

После застывания среды чашки с посевами помещают в термостат вверх дном и инкубируют при температуре (24 +/- 1) °С в течение (120 +/- 3) часов.

12.2.2. Двухслойный агаровый метод.

Исследуемый материал в количестве 1 куб.см из соответствующего разведения (или 1 куб.см нативного продукта в жидкой форме) вносят стерильной пипеткой в две пробирки с 4 куб.см предварительно расплавленной и охлажденной до температуры (45 +/- 1) °С агаризованной среды Сабуро. Быстро перемешивают содержимое пробирок и переносят в две параллельные чашки Петри с застывшей агаризованной средой Сабуро, распределяя его равномерно по поверхности среды.

После застывания чашки перемещают в термостат вверх дном и термостатируют при температуре (24 +/- 1) °С в течение (120 +/- 3) часов.

12.3. Обработка и выражение результатов.

Предварительный учет типичных колоний проводят через (72 +/- 3) часа термостатирования посевов, а окончательный - через (120 +/- 3) часов. Результаты оцениваются по каждой пробе отдельно.

На поверхности плотной среды рост и развитие дрожжей характеризуются появлением плоских или выпуклых колоний белого или кремового, иногда серо-белого цвета. В глубине агара дрожжи образуют чечевицеобразные колонии.

Развитие плесневых грибов характеризуется появлением сметанообразных, слизистых колоний различной окраски с последующим опушением.

Для количественного подсчета отбирают чашки, на которых выросло от 5 до 150 колоний дрожжей и плесневых грибов, колонии суммируют и вычисляют среднее арифметическое значение из посевов одного разведения.

Допускается учитывать колонии с помощью лупы с пятикратным увеличением.

Полученное среднее арифметическое число колоний округляют, как описано в подпункте 11.3.

Общее количество плесневых грибов и дрожжей Х вычисляют по формуле

                                         N
                                   a x 10
                               X = -------,
                                      q

где a - округленное среднее арифметическое число колоний;
    q - объем посевного материала, внесенного в чашки, куб.см;
    N - степень десятикратного разведения образца продукта.

                                                                 N
     Результаты  анализа  выражают  числом  (от  1,0 до 9,9) х 10 , где N -
соответствующая степень десятикратного разведения продукта.
     Если среднее арифметическое значение числа колоний дрожжей и плесневых
грибов меньше 5, то результаты выражают следующим образом:

                                                                          N
общее количество плесневых грибов и / или дрожжей меньшее 5 умножают на 10
                                                                        ---
                                                                         q
КОЕ/г (куб.см).

Если на чашках с разведением 1:10 не обнаружено роста плесневых грибов и дрожжей, то результат записывают так: "не обнаружены".

Если на чашках выросло более 150 колоний дрожжей и плесневых грибов, то учитывают результаты на чашках с последующим разведением.

13. Выделение и идентификация бактерий семейства Enterobacteriaceae.

13.1. Сущность метода.

Метод основан на выявлении бактерий семейства Enterobacteriaceae с использованием накопительных и селективных питательных сред с дальнейшей идентификацией выявленных бактерий по нижеследующим биохимическим тестам.

К семейству Enterobacteriaceae относятся грамотрицательные неспорообразующие палочки, которые дают отрицательную оксидазную реакцию, ферментируют глюкозу с образованием кислоты и восстанавливают нитраты в нитриты.

13.2. Проведение анализа.

Подготовленный образец в количестве 10 куб.см (или 1 куб.см нативного продукта в жидкой форме) вносят стерильной пипеткой во флакон с 90 куб.см (9 куб.см для нативного продукта в жидкой форме) одной из питательных сред, приготовленных по подпункту 5.3. При нормировании отсутствия бактерий семейства Enterobacteriaceae в 10 г продукции вносят 10 г образца в нативном виде во флакон с 90 куб.см одной из питательных сред, приготовленных по подпункту 5.3.

Содержимое перемешивают и инкубируют при температуре (37 +/- 1) °С в течение (24 - 48 +/- 3) часов. При наличии признаков роста на средах (помутнение среды, изменение ее цвета) делают пересев петлей обогащенной культуры на среду Эндо, разлитую в две стерильные чашки Петри в количестве (10 - 15) куб.см, которые инкубируют при температуре (37 +/- 1) °С в течение (24 - 48 +/- 2) часов.

Если после инкубации на среде Эндо отмечен рост колоний темно-красного цвета с металлическим блеском и без него или розовых, бесцветных, выпуклых, диаметром (2 - 4) мм, т.е. подозрительных на принадлежность к семейству Enterobacteriaceae, проводят подтверждающие идентифицирующие тесты.

Петлей снимают подозрительные колонии (каждую отдельно) и готовят мазки на предметных стеклах для окраски по Граму. Мазки фиксируют трехкратным проведением над пламенем. На препарат накладывают полоску фильтровальной бумаги, на нее наливают пипеткой (0,5 - 1,0) куб.см карболового раствора генциана фиолетового на 1 мин. Затем бумагу снимают, на препарат пипеткой наливают (0,5 - 1,0) куб.см раствора Люголя, выдерживают в течение 1 мин, препарат тщательно промывают спиртом этиловым ректификатом, затем - водой дистиллированной и докрашивают (1 - 2) мин раствором фуксина Циля, предварительно разведенным водой дистиллированной в объемном соотношении 1:10. Учитывают наличие грамотрицательных неспорообразующих палочек (окрашенных в розовый цвет).

Колонии, выросшие на среде Эндо, подозрительные по морфологии (каждую отдельно), пересевают петлей на одну из скошенных сред по подпункту 5.1. Посевы инкубируют при (37 +/- 1) °С в течение (24 +/- 3) ч.

Полученные чистые культуры наносят штрихом на фильтровальную бумагу, предварительно смоченную реактивом для определения цитохромоксидазы. В месте внесения бактериальной массы бумага не изменяет цвета, если оксидазный тест отрицательный, и синеет в течение 2 - 5 мин, если бактерии обладают оксидазой активностью.

Культуры пересевают петлей на среду для определения ферментации глюкозы, приготовленную по подпункту 5.4.2 (допускается проведение O/F-теста). В половину пробирок со средой для определения ферментации глюкозы вносят 0,5 куб.см стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют при (37 +/- 1) °С в течение (24 +/- 3) часов. При наличии роста ферментацию глюкозы устанавливают по изменению цвета среды из красного в желтый в пробирках с маслом и без него.

При проведении O/F-теста посев производят уколом в два столбика со средой Хью-Лейфсена, приготовленной по подпункту 5.4.4, один из которых заливают 1 куб.см стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют при (37 +/- 1) °С в течение (24 +/- 3) часов. При положительной реакции происходит изменение цвета среды из зеленого в желтый при культивировании как в аэробных, так и в анаэробных условиях.

Параллельно исследуемые культуры пересевают петлей на среду для определения способности восстанавливать нитраты в нитриты, приготовленную по подпункту 5.4.3. Посевы инкубируют при (37 +/- 1) °С в течение (24 +/- 3) часов. О наличии нитритов в среде судят по появлению красного окрашивания при внесении в среду реактива Грисса (по подпункту 4.6). К суточной культуре на среде для определения способности восстанавливать нитраты в нитриты приливают (0,2 - 0,3) куб.см реактива Грисса, погружая пипетку до дна пробирки. Появление красного окрашивания свидетельствует о наличии нитратов.

13.3. Обработка и выражение результатов.

Если в исследуемом образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие палочки, которые дают отрицательную оксидазную реакцию, ферментируют глюкозу с образованием кислоты и восстанавливают нитраты в нитриты, это значит, что парфюмерно-косметическое средство контаминировано бактериями семейства Enterobacteriaceae. Результат выражают следующим образом: в М г (куб.см) продукта обнаружены бактерии семейства Enterobacteriaceae (условное обозначение - "Enterob. обн."), где М - масса (объем) продукта, в котором выявляли бактерии семейства Enterobacteriaceae.

В исследуемом образце парфюмерно-косметического средства бактерии семейства Enterobacteriaceae отсутствуют, если при визуальном контроле на чашках с соответствующими средами после инкубации не обнаруживают колоний с характерной морфологией (см. подпункт 13.2). Результат выражают следующим образом: в М г (куб.см) продукта бактерии семейства Enterobacteriaceae не обнаружены (условное обозначение - "Enterob. н.о."), где М - масса (объем) продукта, в котором выявляли бактерии семейства Enterobacteriaceae.

14. Выделение и идентификация бактерий вида Pseudomonas aeruginosa.

14.1. Сущность метода.

Метод основан на выявлении бактерий вида Pseudomonas aeruginosa с использованием накопительных и селективных питательных сред с последующей идентификацией выявленных бактерий по нижеследующим биохимическим тестам.

Бактерии вида Pseudomonas aeruginosa представляют собой грамотрицательные неспорообразующие палочки, которые дают положительную оксидазную реакцию, образуют проникающий в субстрат пигмент феназинового ряда, имеющий буроватый оттенок с вариантами от сине-зеленого (пиоцианин) до коричнево-красного, и способны к росту при температуре (42 +/- 1) °С.

14.2. Проведение анализа.

Подготовленный образец в количестве 10 куб.см (или 1 куб.см нативного продукта в жидкой форме) вносят стерильной пипеткой во флакон с 90 куб.см (9 куб.см для нативного продукта в жидкой форме) одной из питательных сред, приготовленных по подпункту 5.5. При нормировании отсутствия бактерий вида Pseudomonas aeruginosa в 10 г продукции вносят 10 г образца в нативном виде во флакон с 90 куб.см одной из питательных сред, приготовленных по подпункту 5.5.

Содержимое перемешивают и инкубируют при температуре (37 +/- 1) °С в течение (24 - 48 +/- 3) часов. При наличии признаков роста в среде делают пересев обогащенной культуры петлей на одну из сред по подпункту 5.1, инкубируют при температуре (37 +/- 1) °С в течение (24 - 48 +/- 3) часов.

При наличии роста характерных колоний, обладающих специфическим неприятным запахом, выделяющих сине-зеленый пигмент пиоцианин, колонии микроскопируют и исследуют на наличие фермента цитохормоксидазы.

При микроскопировании мазков, окрашенных по Граму по подпункту 13.2, учитывают наличие грамотрицательных неспорообразующих палочек.

Колонии, подозрительные по морфологии (каждую отдельно), пересевают петлей на одну из скошенных сред по подпункту 5.1. Посевы инкубируют при (37 +/- 1) °С в течение (24 +/- 3) ч.

Выросшие культуры наносят штрихом на фильтровальную бумагу, предварительно смоченную реактивом для определения цитохромоксидазы. В месте внесения бактериальной массы бумага не изменяет цвета, если оксидазный тест отрицательный, и синеет в течение 2 - 5 мин, если бактерии обладают оксидазой активностью.

Оксидазоположительные колонии пересевают на среду Кинг-А (по подпункту 5.6) и инкубируют при температуре (37 +/- 1) °С в течение (24 - 48 +/- 3) часов. На среде Кинг-А бактерии вида Pseudomonas aeruginosa образуют пигмент феназинового ряда, имеющий буроватый оттенок с вариантом от сине-зеленого (пиоцианин) до коричнево-красного и проникающий в субстрат.

Для дополнительного подтверждения принадлежности к виду Pseudomonas aeruginosa чашки со средой Кинг-А инкубируют при температуре (42 +/- 1) °С в течение (24 +/- 3) часов. Культура Pseudomonas aeruginosa растет в вышеуказанных условиях с образованием сине-зеленого пигмента.

14.3. Обработка и выражение результатов.

Если в результате исследований обнаружены колонии грамотрицательных неспорообразующих палочек, дающих положительную оксидазную реакцию, образующие пигмент или без него и дающие рост при 42 °С, считают, что парфюмерно-косметическое средство контаминировано Pseudomonas aeruginosa. Результат выражают следующим образом: в М г (куб.см) продукта обнаружены бактерии вида Pseudomonas aeruginosa (условное обозначение - "Ps. aerug. обн."), где М - масса (объем) продукта, в котором выявляли бактерии вида Pseudomonas aeruginosa.

В исследуемом образце парфюмерно-косметического средства бактерии вида Pseudomonas aeruginosa отсутствуют, если при визуальном контроле на чашках со средами после инкубации не обнаруживают характерных по морфологии колоний (см. подпункт 14.2). Результат выражают следующим образом: в М г (куб.см) продукта бактерии вида Pseudomonas aeruginosa не обнаружены (условное обозначение - "Ps. aerug. н.о."), где М - масса (объем) продукта, в котором выявляли бактерии вида Pseudomonas aeruginosa.

15. Выделение и идентификация бактерий вида Staphylococcus aureus.

15.1. Сущность метода.

Метод основан на выявлении бактерий вида Staphylococcus aureus с использованием накопительных и селективных питательных сред с дальнейшей идентификацией выявленных бактерий по нижеследующим биохимическим тестам.

Бактерии вида Staphylococcus aureus представляют собой грамположительные кокки, обладающие лецитиназной активностью, сбраживающие маннит в аэробных и анаэробных условиях или мальтозу в анаэробных условиях и дающие положительную реакцию плазмокоагуляции.

15.2. Проведение анализа.

Подготовленный образец в количестве 10 куб.см (или 1 куб.см нативного продукта в жидкой форме) вносят стерильной пипеткой во флакон с 90 куб.см (9 куб.см для нативного продукта в жидкой форме) одной из питательных сред, приготовленной по подпункту 5.7. При нормировании отсутствия бактерий вида Staphylococcus aureus в 10 г продукции вносят 10 г образца в нативном виде во флакон с 90 куб.см одной из питательных сред, приготовленных по подпункту 5.7.

Содержимое перемешивают и инкубируют при температуре (37 +/- 1) °С в течение (24 - 48 +/- 3) часов. При наличии признаков роста делают пересев обогащенной культуры петлей на одну из следующих сред: желточно-солевой агар (по подпункту 5.8.1), агар Байрд-Паркер (по подпункту 5.8.2), маннитно-солевой агар (по подпункту 5.8.3). Посевы на желточно-солевом агаре и агаре Байрд-Паркер инкубируют при температуре (37 +/- 1) °С в течение (48 +/- 3) часов, а посевы на маннитно-солевом агаре - (24 - 48 +/- 3) часов.

При росте на желточно-солевом агаре бактерии вида Staphylococcus aureus образуют круглые, слегка возвышающиеся над поверхностью агара колонии с ровными краями диаметром 2 - 2,5 мм, окрашенные в желтый, золотистый, кремовый, палевый или белый цвет, окруженные зоной лецитиназной активности.

На среде Байрд-Паркер бактерии вида Staphylococcus aureus растут в виде черных блестящих колоний диаметром 1 - 1,5 мм, окруженных зоной лецитиназной активности.

Наличие на маннитно-солевом агаре колоний, окруженных желтыми зонами, свидетельствует о способности этих микроорганизмов ферментировать маннит.

При наличии характерных колоний производят микроскопию и при необходимости исследуют на наличие фермента плазмокоагулазы.

Из подозрительных по морфологии колоний делают мазки и окрашивают по Граму. Стафилококки по Граму окрашиваются положительно, имеют шарообразную или близкую к ней форму с диаметром (0,6 - 1,0) мкм и располагаются обычно в виде скоплений, напоминающих гроздья винограда.

Отсутствие в мазках грамположительных кокков, окрашенных в сине-фиолетовый цвет и расположенных скоплениями в виде гроздьев, свидетельствует об отсутствии стафилококков. В этом случае дальнейшие исследования не проводят.

При обнаружении грамположительных кокков делают пересев на одну из скошенных сред, приготовленных по подпункту 5.1. Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °С в течение (24 +/- 3) часов. Выделенную чистую культуру пересевают на среду Гисса с маннитом или мальтозой, приготовленную по подпункту 5.8.4, разлитую высоким столбиком (посев производят уколом). Инкубируют при температуре (37 +/- 1) °С в течение (24 +/- 3) часов. В случае роста стафилококков на среде Гисса с маннитом или мальтозой наблюдаются ферментация или окисление углевода, сопровождающиеся изменением цвета среды.

Выделенную чистую культуру исследуют на наличие фермента плазмокоагулазы. Для проведения реакции сухую кроличью цитратную плазму разводят согласно наставлению по применению и разливают по 0,5 куб.см в четыре стерильные пробирки. В пробирки с раствором плазмы вносят по одной петле исследуемой суточной культуры с каждой пробирки со средой, приготовленной по подпункту 5.1 и инкубируют при температуре (37 +/- 1) °С в течение (4 - 6) часов. Обязательна постановка двух параллельных контролей: первый контроль - пробирка только с раствором плазмы; второй контроль - пробирка с раствором плазмы, в которую внесена суточная культура стафилококка, заведомо обладающего ферментом коагулазой. Если в эти сроки не наблюдается свертывание плазмы в опытной и первой контрольных пробирках, то реакция плазмокоагуляции считается отрицательной, если плазма в опытной пробирке коагулирована аналогично второму контролю, то реакция считается положительной.

15.3. Обработка и выражение результатов.

Если в результате исследований обнаружены колонии грамположительных кокков, ферментирующие маннит в аэробных и анаэробных условиях или мальтозу в анаэробных условиях, обладающие лецитиназной активностью и дающие положительную реакцию плазмокоагуляции, считают, что парфюмерно-косметическое средство контаминировано Staphylococcus aureus. Результат выражают следующим образом: в М г (куб.см) продукта обнаружены бактерии вида Staphylococcus aureus (условное обозначение - "St. aur. обн."), где М - масса (объем) продукта, в котором выявляли бактерии вида Staphylococcus aureus.

В исследуемом образце парфюмерно-косметического средства бактерии вида Staphylococcus aureus отсутствуют, если при визуальном контроле на чашках со средами после инкубации не обнаруживают характерных по морфологии колоний (см. подпункт 15.2) или при выявлении подозрительных колоний микроскопией не подтверждают наличие грамположительных кокков. Результат выражают следующим образом: в М г (куб.см) продукта бактерии вида Staphylococcus aureus не обнаружены (условное обозначение - "St. aur. н.о."), где М - масса (объем) продукта, в котором выявляли бактерии вида Staphylococcus aureus.

16. Испытание парфюмерно-косметической продукции на стерильность.

16.1. Метод прямого посева.

Метод основан на способности большинства аэробных и анаэробных бактерий давать видимый рост на тиогликолевой среде, а плесневых грибов и дрожжей - на среде Сабуро.

Из объединенной пробы, приготовленной по пункту 8, отбирают стерильно (10,0 +/- 0,1) г (куб.см) испытуемого средства и высевают в два стеклянных флакона (параллельные определения), содержащие 90 куб.см жидкой среды Сабуро, приготовленной по подпункту 5.2.2, и 90 куб.см тиогликолевой среды, приготовленной по подпункту 5.9 соответственно.

Посевы в среде Сабуро инкубируют при температуре (24 +/- 1) °С, а посевы в тиогликолевой среде при температуре (30 +/- 1) °С в течение 14 сут. Посевы просматривают ежедневно.

16.2. Метод мембранных фильтров.

Метод мембранных фильтров основан на фильтрации растворов через мембранные фильтры с размером пор не более (0,45 +/- 0,02) мкм, на которых улавливается основное количество микроорганизмов, с последующим культивированием их в тиогликолевой среде и в жидкой среде Сабуро.

Фильтрование проводят в стерильных условиях с использованием фильтрационной установки.

Для фильтрации используют нитратцеллюлозные мембранные фильтры с размером пор (0,45 +/- 0,02) мкм, диаметром около 47 мм (мембрана "Владипор" типа МФАС-Б5 или МФА-МА-N5, Millipore или другие, удовлетворяющие этим требованиям).

Фильтрование проводят под вакуумом 93,3 кПа (70 мм рт. ст.).

Для фильтрования образцов, содержащих небольшое количество взвешенных веществ, используют предварительную фильтрацию через префильтр. В качестве префильтров можно использовать фильтры типа АР 15 (Millipore), картон для предварительной фильтрации марки КФБЖ, картон для предварительной фильтрации марки КФМП и другие материалы, способные эффективно задерживать твердые частицы.

Пробу, подготовленную по пункту 8, немедленно фильтруют. Фильтрацию заканчивают в момент исчезновения влаги на поверхности фильтра. После окончания фильтрации мембрану отмывают 3 - 5 порциями по 100 куб.см стерильного физиологического раствора для полного удаления с поверхности фильтра веществ, препятствующих росту микроорганизмов.

После отмывания мембрану немедленно извлекают из фильтродержателя, разрезают стерильными ножницами пополам и одну половину помещают в стеклянный флакон, содержащий 100 куб.см жидкой среды Сабуро, приготовленной по подпункту 5.2.2, а вторую половину - в стеклянный флакон, содержащий 100 куб.см тиогликолевой среды, приготовленной по подпункту 5.9 соответственно.

Посевы в среде Сабуро инкубируют при температуре (24 +/- 1) °С, а посевы в тиогликолевой среде - при температуре (30 +/- 1) °С в течение 7 сут.

16.3. Обработка результатов.

Посевы просматривают в рассеянном свете ежедневно и по окончании периода инкубации. Наличие роста микроорганизмов в питательных средах оценивают визуально по появлению мутности, пленки, осадка и других макроскопических изменений. Выявленный рост микроорганизмов подтверждают микрокопированием.

Испытуемая продукция считается стерильной при отсутствии роста микроорганизмов.

При обнаружении роста хотя бы в одном флаконе его подтверждают микроскопированием и повторяют испытание на таком же количестве образцов, как и в первый раз. В случае роста при повторном испытании микроорганизмов, морфологически сходных с микроорганизмами, выявленными при первичном посеве, испытуемую продукцию считают нестерильной.

Если при повторном посеве наблюдается рост микроорганизмов, отличающихся по морфологии от первоначально выделенных, испытание проводят в третий раз на удвоенном количестве образцов. При наличии роста хотя бы в одном флаконе при третьем испытании косметическую продукцию считают нестерильной.

Страницы: | Стр. 1 | Стр. 2 | Стр. 3 | Стр. 4 | Стр. 5 | Стр. 6 | Стр. 7 | Стр. 8 | Стр. 9 | Стр. 10 | Стр. 11

Архів документів Папярэдні | Наступны


	Под общей редакцией Валерия Левоневского