Инструкция Главного государственного санитарного врача Республики Беларусь от 08.05.2009 № 049-0509 "Лабораторная диагностика заболевания людей высокопатогенным вирусом гриппа A(H1N1)"

Текст документа с изменениями и дополнениями по состоянию на ноябрь 2013 года

< Главная страница

                                                 УТВЕРЖДАЮ
                                                 Главный государственный
                                                 санитарный врач
                                                 Республики Беларусь
                                                 Качан В.И.
                                                 8 мая 2009 г.
                                                 регистрационный N 049-0509

Учреждение-разработчик: Государственное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии"

Область применения: Инструкция предназначена для вирусологических лабораторий санитарно-эпидемиологической службы, лабораторной службы ЛПУ, занимающихся диагностикой гриппа и ОРВИ.

РАЗДЕЛ I ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

ГЛАВА 1 ХАРАКТЕРИСТИКА ВЫСОКОПАТОГЕННОГО ВИРУСА ГРИППА A(H1N1)

В конце марта - начале апреля 2009 года в Мексике и США были зафиксированы вспышки заболеваний людей, обусловленные вирусом гриппа свиней. Выделенный вирус отличался по антигенным характеристикам от вируса гриппа свиней, циркулировавшего ранее на территории США. По состоянию на 05.05.2009 в 21 стране зарегистрировано 1124 лабораторно подтвержденных случая заболевания людей, из которых 26 закончились летально. Учитывая усложняющуюся эпидемическую обстановку и основываясь на оценке всей имеющейся информации, генеральный директор Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), доктор Маргарет Чен приняла решение о поднятии нынешнего уровня готовности к пандемии гриппа с 4-го на 5-й уровень. Данный уровень готовности подразумевает усиление лабораторной диагностики гриппоподобных заболеваний и раннее выявление нового возбудителя.

Высоко патогенный вирус гриппа A(H1N1) (ВПВГА) относится к семейству Ортомиксовирусов. Геном вируса представлен восемью фрагментами РНК. По данным генетического анализа, вирус гриппа, вызвавший вспышку заболевания среди людей в Мексике и США, является реассортантом вирусов гриппа свиней североамериканской и евроазиатской филогенетических ветвей.

Вирус чувствителен к озелтамивиру и занамивиру. К препаратам адамантанового ряда вирус устойчив. Вирус ограниченно передается от человека к человеку воздушно-капельным путем. Не исключен также и контактно-бытовой способ передачи. Инкубационный период при гриппе ВПВГА, как показали немногочисленные исследования, составляет обычно 2 - 3 дня, и вирус может выделяться в окружающую среду заболевшим 7 дней и более. Клиническая картина заболеваний отличается разнообразием (от бессимптомных форм до тяжелых пневмоний).

Вирус чувствителен к повышенным температурам и погибает при нагревании до 70 °C в течение 30 минут. Вирус также чувствителен к различным дезинфектантам, обладающим вирулицидным действием.

ГЛАВА 2 ОПРЕДЕЛЕНИЕ СЛУЧАЕВ ЗАБОЛЕВАНИЯ

В соответствии с временным руководством по определению заболевания (СДС, Атланта, США) при проведении мероприятий по расследованию случаев заболевания людей ВПВГА для использования приняты следующие определения респираторных заболеваний.

Острое респираторное заболевание (ОРЗ) - недавнее проявление двух из следующих признаков:

1. Ринорея, или заложенность носа;

2. Ангина;

3. Кашель;

4. Жар или лихорадочное состояние.

Гриппоподобное заболевание - жар с температурой выше 37,8 °C в сочетании с кашлем или ангиной.

Определения случаев заболевания, вызванных инфицированием ВПВГА

Подтвержденный случай. Подтвержденным случаем гриппа ВПВГА считается заболевание, при котором имеются симптомы ОРЗ с лабораторно подтвержденной в НЦГ инфекцией, вызванной ВПВГА, одним из следующих методов:

- ОТ-ПЦР в режиме реального времени;

- выделение вируса в культуре клеток.

Вероятный случай. А. У человека имеет место ОРЗ, при этом результат ОТ-ПЦР положительный на грипп типа А, но отрицательный на подтип H1 или H3.

Подозрительный случай - случай, при котором:

- у человека имеет место ОРЗ, и этот человек тесно контактировал с лицом с подтвержденной инфекцией, вызванной ВПВГА, в то время, когда это лицо находилось в состоянии болезни, или

- У человека имеет место ОРЗ, и известно, что этот человек недавно контактировал с животным с подтвержденной или подозреваемой инфекцией, вызванной ВПВГА, или

- у человека имеет место ОРЗ, и этот человек совершил поездку в район, где имеют место подтвержденные случаи ВПВГА.

При поступлении из организации здравоохранения информации о подтвержденном, вероятном или подозрительном случае заболевания людей ВПВГА, специалистами регионального центра гигиены и эпидемиологии немедленно проводится эпидемиологическое расследование.

РАЗДЕЛ II ОРГАНИЗАЦИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ

ГЛАВА 3 СБОР, ХРАНЕНИЕ И ТРАНСПОРТИРОВКА ОБРАЗЦОВ ДЛЯ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ

Сбор клинического материала и его упаковку осуществляет медицинский работник лечебно-профилактического учреждения, обученный требованиям и правилам биологической безопасности при работе и сборе материала, подозрительного на зараженность ВПВГА. Забор производят в стерильные одноразовые флаконы, пробирки, контейнеры стерильными инструментами.

Упаковка, маркировка, условия хранения и транспортирования материала для проведения лабораторной диагностики ВПВГА осуществляются в соответствии с Руководством N-11-7-13-2002 от 30.12.2002 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортировки микроорганизмов 1 - 4 групп патогенности". Для диагностики заболевания могут быть использованы следующие образцы:

- аспират из носоглотки;

- мазок из носа;

- мазок из носоглотки;

- смыв из носовой полости.

По клиническим показаниям к ним могут быть добавлены:

- трахеальный аспират;

- бронхоальвеолярный лаваж;

- биоптат легочной ткани;

- ткань легкого или трахеи, взятая post mortem.

Данные процедуры осуществляет подготовленный медицинский персонал. Перечисленные выше процедуры по забору клинического материала обученный медицинский персонал осуществляет в средствах индивидуальной защиты органов дыхания (респиратор типа ШБ-1 или РБ "Лепесток-200"), защитных очках или щитках для защиты лица, бахилах, двойными резиновыми перчатками.

Для забора назофарингеальных мазков используют пластиковые палочки с синтетическим тампоном. Палочки с хлопковыми тампонами использовать не рекомендуется.

После процедуры отбора материала перчатки обрабатываются растворами дезинфицирующих средств, руки после снятия перчаток обрабатываются антисептиками в соответствии с СП 1.2.011-94 "Безопасность работы с микроорганизмами 1, 2 групп патогенности".

Оптимальным сроком забора клинического материала, предназначенного для выявления ВПВГА, являются первые 3 дня после появления симптомов заболевания. Техника забора клинического материала подробно описана в постановлении N 48 "О мероприятиях по профилактике гриппа и других респираторных вирусных инфекций" от 1 ноября 2000 г.

Образцы из дыхательных путей должны собираться и доставляться в средах для транспортировки.

Среда для транспортировки клинического образца: в 1 литр раствора Хэнкса, содержащего 0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА), добавить:

                               6
     - бензилпенициллин (2 x 10  МЕ/л)
     - стрептомицин (200 мг/л)

                           6
     - полимиксин Б (2 x 10  МЕ/л)
     - гентамицин (250 мг/л)

                         6
     - нистатин (0,5 x 10  МЕ/л)
     - офлоксацина гидрохлорид (60 мг/л)
     - сульфометаксозол (0,2 г/л)

Если образец не может быть обработан в течение 1 - 72 часов, он должен храниться в замороженном состоянии при температуре от -70 °C и ниже. Необходимо не допускать повторного замораживания и оттаивания при транспортировке во избежание потери инфекционности.

При проведении лабораторных исследований клинических образцов следует учитывать, что инфицированные клетки респираторного эпителия в клинических образцах очень неустойчивы и легко повреждаются. Поэтому они должны храниться на льду по ходу обработки и не должны центрифугироваться более чем при 500 об/мин.

Образцы вирусов гриппа не должны храниться или перевозиться в сухом льду (твердом диоксиде углерода), если они не запаяны в стекло или запечатаны, закрыты и запаяны в двойную пластиковую упаковку. Такая упаковка образца объясняется тем, что углекислый газ способен быстро инактивировать вирусы гриппа, если он проникает в образец в результате сжатия пробок при замораживании.

Транспортировка образцов должна осуществляться в соответствии с Руководством N-11-7-13-2002 от 30.12.2002 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортировки микроорганизмов 1 - 4 групп патогенности".

Все транспортируемые образцы должны быть упакованы в тройную упаковку, содержащую три упаковочных слоя. Упаковка должна выдерживать удары и нагрузки, имеющие место при транспортировке. Упаковка должна быть выполнена с учетом предотвращения любой утечки содержимого.

Первичные емкости должны быть защищены от утечки, и их объем не должен превышать 500 мл. Между первичной емкостью и вторичной упаковкой должен находиться абсорбирующий материал; если несколько первичных емкостей помещаются во вторичную упаковку, каждая из них должна быть отдельно завернута или отделена таким образом, чтобы исключить контакт между ними. Абсорбирующего материала должно быть достаточно, чтобы полностью впитать все содержимое первичных емкостей, а вторичная упаковка должна быть защищена от протечек. Первичная емкость или вторичная упаковка должны выдерживать внутреннее давление, при разнице давления не менее 95 КПа (0,05 бар). Внешняя упаковка должна содержать не более 4 литров.

Для авиатранспортировки внешний размер готовой упаковки должен быть не менее 10 см.

3. Координация деятельности учреждений, осуществляющих диагностику ВГА

Забор материала от пациентов (или умерших) с подозрением на инфекцию ВПВГА проводят в лечебно-профилактических учреждениях (ЛПУ) после изоляции больного.

Первичное исследование материала от больного осуществляют методами ОТ-ПЦР в режиме реального времени на базе вирусологических лабораторий областных центров гигиены, эпидемиологии и общественного здоровья (ОЦГЭиОЗ) и Минского городского центра гигиены и эпидемиологии (МГЦГЭ) для исключения ВПВГА. Выделение РНК ВПВГА должно проводиться в условиях бокса биологической защиты 2-го класса.

При исследовании методом ОТ-ПЦР анализ проводится в два этапа:

- исследование по обнаружению вирусов гриппа A с помощью тестов "АмплиСенс Influenza virus A/B-FL" или "АмплиСенс Influenza virus A/H5N1-FL";

- исследование по идентификации субтипов H1N1 и H3N2 вирусов гриппа A, вызывающих сезонный грипп человека с помощью теста "АмплиСенс Influenza virus A-тип-FL".

Ко второму этапу анализа следует приступать при получении положительного результата по обнаружению вируса гриппа A на первом этапе.

Интерпретация результатов исследования

Обнаружив грипп А с помощью тестов "АмплиСенс Influenza virus A/B-FL" или "АмплиСенс Influenza virus A/H5N1-FL" (в реакции с ПЦР-смесь-1-FEP/FRT Influenza virus A) и получив отрицательные результаты с тестом "АмплиСенс Influenza virus A-тип-FL", можно сделать вывод, что в образце присутствует нехарактерный для популяции людей вирус гриппа A (свиней или птиц).

Такие клинические образцы без проведения выделения возбудителя на культуре клеток направляются в НЦГ с соблюдением условий транспортировки в соответствии с Руководством N-11-7-13-2002 от 30.12.2002 "Порядок учета, хранения, передачи и транспортировки микроорганизмов 1 - 4 групп патогенности". Дополнительно к образцу на электронный адрес НЦГ nvg@riem.bn.by высылается результат проведенных исследований в виде протокола программы.

В случае положительного результата второго этапа анализа (идентификация субтипов H1N1 и H3N2 вирусов гриппа A, вызывающих сезонный грипп человека) больному ставится диагноз "сезонный грипп" и клинический образец направляется в НЦГ для подтверждения лабораторного диагноза.

Подтверждающее тестирование положительных образцов осуществляется в НЦГ с обязательным использованием двух методов: вирусологического исследования (выделение вируса должно осуществляться в условиях лаборатории с уровнем защиты BSL-3) и ОТ-ПЦР. Результаты исследований в каждом случае сообщают в учреждение, направившее материал для исследования, в Республиканский центр гигиены и эпидемиологии и общественного здоровья (РЦГЭиОЗ) и Министерство здравоохранения Республики Беларусь (МЗ РБ).

При получении положительных результатов подтверждающего тестирования НЦГ проводит выделение вируса, изучение его свойств и депонирование в Специализированную коллекцию вирусов и бактерий, патогенных для человека. Кроме того, вирус направляется в диагностические центры ВОЗ (Лондон, Великобритания или Атланта, США).

ГЛАВА 4 ПОРЯДОК И МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ВПВГА

4.1. Порядок работы с клиническим образцом

Доставленный в лабораторию маркированный материал в боксе 2-го класса защиты делят на три части:

- для постановки ОТ-ПЦР - 0,5 мл;

- для культуральных исследований - 0,5 - 0,6 мл;

- контрольный образец - 0,5 - 0,6 мл.

Контрольный образец хранят при -70 °C, остальные две части направляются для соответствующего исследования.

4.2. Методы лабораторной диагностики

В связи с тем, что вследствие мутаций вновь появившиеся высокопатогенные штаммы вируса гриппа свиней изменили свои антигенные свойства, на настоящем этапе выявление антигена ВПВГА методом иммунофлуоресцирующих антител (МФА) может давать ложноотрицательные результаты.

ОТ-ПЦР в режиме реального времени

Выявление РНК вируса гриппа A осуществляется с использованием диагностических тест-систем "АмплиСенс" ФГУН "ЦНИИ эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека в соответствии с прилагаемой инструкцией производителя. Результаты исследования могут быть получены в течение 24 часов.

Выделение вируса в культуре клеток

Метод позволяет, помимо идентификации возбудителя, проводить дальнейшее изучение антигенных, фенотипических и генетических свойств возбудителя, а также определять его чувствительность к лекарственным препаратам.

Для выделения вирусов гриппа, в том числе ВПВГА, используют культуру клеток МДСК. Клетки МДСК являются оптимальной клеточной системой. При использовании культуры клеток необходимо помнить, что культура МДСК сохраняет высокую чувствительность к вирусам гриппа A и B на протяжении 60 - 80 пассажей. Во избежание "старения" культуры и снижения ее чувствительности к вирусу гриппа субкультивирование проводят каждые 4 - 7 дней.

Материалом для выделения вирусов служит отделяемое из глубоких отделов носовой полости, зева, а также секционные ткани легкого и бронхов. Для успешного выделения вирусов оптимальным является незамедлительное заражение клеточной культуры, поскольку при хранении материала инфекционная активность вирусов падает. При отсутствии монослойной культуры на момент поступления клинических образцов последние могут храниться в лаборатории до заражения при +4 °C не более 2 дней. Для более длительного хранения они должны быть заморожены при температуре не выше -70 °C. Для сохранения инфекционности вируса следует избегать повторного замораживания-оттаивания образца.

Материалы и оборудование <*>

Среда для выделения вируса:

ДМЕМ (Сигма, кат. N Д1152), содержащая Трипсин - ТРСК (тип XIII из поджелудочной железы быка, Сигма, кат. N Т-Т1426) в конечной концентрации 2 мкг/мл.

5. Культура клеток МДСК линии CCL 34.

6. Материалы и оборудование для постановки реакции ГА и РТГА:

- планшеты для иммунологических реакций;

- дозатор 8-канальный, рабочий объем 2 - 200 мкл;

- дозатор 1-канальный, рабочий объем 2 - 200 мкл;

- взвесь эритроцитов человека 0 (1) группы крови 0,75% или 1% взвесь куриных эритроцитов;

- физиологический раствор;

- сыворотка диагностическая гриппозная.

7. Оборудование:

- холодильник бытовой (4 +/- 1) °C;

- рефрижератор (-70 +/- 1) °C;

- центрифуга лабораторная (до 6000 об/мин);

- термостат (37 +/- 1) °C;

- микроскоп биологический МБИ-3 или инвертированный;

- пенициллиновые флаконы;

- флаконы культуральные 25 кв.см (кат. N 83.1810 каталог фирмы SARSTEDT);

- пробки резиновые N 14 - 14,5;

- стерильные пипетки на 1, 5 и 10 мл.

--------------------------------

<*> В работе могут быть использованы реактивы и расходные материалы других фирм-производителей, соответствующие по качеству указанным в инструкции.

Подготовка клинического образца к исследованиям

Мазки из носа, глотки и комбинированные назофарингеальные мазки, взятые в первые три дня от момента появления симптомов заболевания, помещают во флакон с 2 мл транспортной среды и в течение 4 - 5 часов доставляют в лабораторию. Транспортировка пробы осуществляется при +4 °C.

Перед заражением монослоя необходимо обработать клинический образец ультразвуком (30 сек при 12 Кгц) или дважды провести процедуру замораживания-оттаивания с целью обогащения проб внутриклеточным антигеном. Энергично встряхнуть флакон и отжать тампон о стенки флакона. Затем удалить тампон и добавить к пробе 0,2 мл гентамицина (10 мг/мл), экспозиция 10 минут при комнатной температуре.

Порядок инфицирования культуры клеток

Необходимое количество сред и растворов готовят непосредственно перед употреблением в зависимости от количества исследуемых образцов. Все растворы перед использованием должны быть подогреты до температуры 35 - 37 °C.

Для выделения вируса необходимо оценить состояние монослоя, который должен быть сливным. В каждом эксперименте предусматривают два контрольных флакона: со сменой и без смены среды.

ВНИМАНИЕ! Все последующие работы с ВПВГА проводятся в ламинарных боксах 2-го класса безопасности.

Из всех флаконов с монослоем аккуратно отсасывают среду роста, кроме контроля без смены среды, и дважды отмывают (по 2 мл) теплым раствором среды ДМЕМ (без сыворотки!). Во флаконы вносят по 0,2 мл образца (на одну пробу используют два флакона). В контрольный флакон со сменой среды добавляют 0,2 мл среды ДМЕМ.

В течение 1 часа при 37 °C проводят адсорбцию.

Затем во флаконы добавляют по 1 мл теплой ДМЕМ (без сыворотки), содержащей ТРСК-трипсин в конечной концентрации 2 мкг/мл.

Флаконы инкубируют при 37 °C, желательно в термостате с подачей 5% CO2, вплоть до 7 суток, ежедневно контролируя состояние монослоя на наличие вирусоспецифического ЦПД.

Через каждые 2 - 3 дня, начиная с 48 часов после заражения, размножение вируса контролируют в реакции гемагглютинации. С этой целью из каждого флакона отбирают по 50 мкл культуральной жидкости. Пробы от одного больного объединяют, и в реакции гемагглютинации определяют титр размножившегося вируса. Реакция ставится микрометодом с 0,75% взвесью эритроцитов человека 0 (1) группы крови или с 1% взвесью эритроцитов кур.

При появлении выраженного ЦПД и / или гемагглютинирующей активности культуральную среду собирают и используют для последующего типирования вируса в РТГА в присутствии специфических диагностических сывороток.

При отрицательном результате клетки разрушают двукратным замораживанием-оттаиванием, объединяют клеточный лизат от одного больного и производят следующий пассаж, контролируя репродукцию вируса по ЦПД и ГА. Если после трех пассажей гемагглютинирующая активность не определяется, то проба считается отрицательной.

Внимание! Внимание! Внимание!

Золотое правило N 1 - никогда не работайте одновременно с клиническими образцами для выделения вирусов и с лабораторно-адаптированными штаммами.

Золотое правило N 2 - никогда не работайте с клиническими образцами человека, свиньи и птиц в одной и той же лаборатории.

Никогда не храните изоляты при -20 °C. Для хранения изолятов используйте морозильную камеру с температурой -70 °C.

Лаборатории, выявившие в клиническом материале РНК вируса гриппа A (либо ВПВГА), должны передать образцы в Государственное учреждение научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии для дальнейшей идентификации и характеристики (тел. 237-62-95, nvg@riem.bn.by).

Укладка для забора материала, подозрительного на инфицирование вирусом гриппа птиц

Бикс 1:

Халат медицинский - 2 шт.

Шапочка - 2 шт.

Маски - 10 шт.

Перчатки - 10 пар

Очки (щитки защитные) - 2 пары

Бикс 2:

Флаконы стерильные (с этикетками) объемом 10 мл, содержащие 2 мл физраствора для забора м-ла - до 10 штук

Шпатель стерильный - 4 шт.

Спирт - 100 мл

Салфетки марлевые стерильные - 4 упаковки

Лейкопластырь - 1 шт.

Ножницы - 1 шт.

Тампоны стерильные (синтетические, не хлопковые) - 10 шт.

Маркер - 1 шт.

Бумага писчая - 5 листов

Ручка - 2 шт.

Сумка-холодильник для транспортировки проб, содержащая термоконтейнер с охлаждающими элементами или термос со льдом, - 1 шт.

Archiv Dokumente Папярэдні | Наступны


	Под общей редакцией Валерия Левоневского