УТВЕРЖДЕНО
Главный государственный
санитарный врач
Республики Беларусь
В.И.Ключенович
31.12.2002 N 146-1102
1. Назначение и область применения
1.1. Настоящая инструкция устанавливает метод лабораторного исследования качества воды хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования на наличие ооцист криптоспоридий с целью безопасности для здоровья человека, проводимого в порядке государственного санитарно-эпидемиологического надзора.
1.2. Инструкция предназначена для применения в лабораториях учреждений, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, а также ведомственный контроль качества воды поверхностных и подземных водоисточников.
2. Методика лабораторного исследования воды на наличие
ооцист криптоспоридий
Методика предназначена для обнаружения в воде ооцист криптоспоридий, представляющих непосредственную угрозу для здоровья человека при их заглатывании, при осуществлении контроля качества воды по паразитологическим показателям в источниках хозяйственно-питьевого водоснабжения (поверхностных водоемах, ручьях, каптажах, колодцах, артезианских скважинах), в распределительной сети систем централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения, а также в водоемах рекреационного назначения.
2.1. Принцип методики
Ооцисты криптоспоридий обнаруживаются при микроскопическом исследовании осадка, получаемого после центрифугирования воды, обработанной коагулянтами, сорбентами и 3-процентной хлористоводородной кислотой. Осаждение ооцист криптоспоридий происходит за счет коагуляции и адсорбции (прилипание, поглощение), внесенных в воду коагулянтов и сорбентов в процессе ее обработки и центрифугирования.
2.2. Чувствительность метода
Метод обладает чувствительностью с пределом обнаружения, равным единичным ооцистам на 1 л воды. Эффективность выделения ооцист криптоспоридий данным методом зависит от исходной концентрации паразитарных патогенов в пробе, объема пробы, мутности, обилия фитопланктона.
3. Оборудование и материалы
3.1. Оборудование
3.1.1. Лабораторная центрифуга типа ОПН-3, ОПН-8, ЦЛС-31М со сменным ротором или другие с аналогичными параметрами, обеспечивающие 1500 - 2500 об/мин (600 - 650 g), позволяющие центрифугировать пробы воды в центрифужных пробирках объемом 10 - 250 мл.
3.1.2. Холодильник электрический или газовый, поддерживающий температуру 4 - 6 град. C.
3.1.3. Термостат электрический типа ТС-80 или аналогичный с автоматическим терморегулятором с ценой деления 0,2 град. C.
3.1.4. Микроскоп биологический (типа МБИ, "Биолам" и др.), снабженный бинокулярной насадкой (АУ-12 и др.), препаратоводителем (типа СТ-12 и др.), имеющий объективы 10, 20, 40 и объектив 90 - 100x масляной иммерсии, а также желательно объектив 40 - 65x водной иммерсии, обеспечивающий увеличение от 100 до 1000 крат, имеющий объектив и укомплектованный окуляр-микрометром и объект-микрометром для калибровки первого, а также имеющий оптику фазового контраста, расширяющую возможности дифференциации ооцист от фитопланктона.
3.1.5. Осветитель ОИ-19 для микроскопа или другой аналогичный с мощностью лампы не менее 50 Ватт.
3.1.6. Весы лабораторные для взвешивания в диапазоне 50 мг - 200 г равноплечные ручные (аптекарские) с разновесами ВЛР-200 и др.:
3.1.7. Денситометры (ареометры) типа 1 (А1) с пределами измерения от 1,000 до 1,400 кг/куб.м ГОСТ 1300-74.
3.1.8. Дозаторы пипеточные П1-0,1, П1-0,5, П1-1,0 мл ТУ 64-339-81 или аналогичные.
3.1.9. Пинцет анатомический.
3.1.10. Стаканы стеклянные высокие с носиком (ВН) номинальной вместимостью 50 - 100 мл ГОСТ 10394-63.
3.1.11. Пробирки центрифужные градуированные (ПЦГ) емкостью 10 мл ГОСТ 1770-64.
3.1.12. Стекла предметные 25 - 75 мм.
3.1.13. Стекла покровные 18 x 18, 24 x 24 мм ГОСТ 6672-59.
3.1.14. Часы песочные на 3 - 5 мин или часы сигнальные.
3.1.15. Штативы лабораторные для пробирок ТУ 64-1-707-80.
3.1.16. Емкости для отбора проб воды из нейтрального материала, пригодные для обеззараживания принятыми методами: канистры пластмассовые емкостью 5 - 10 - 20 - 25 л, стеклянные бутыли, фляги молочные металлические емкостью 30 - 35 л, эмалированные бидоны.
3.1.17. Цилиндры измерительные с носиком 1 - 100, 1 - 250, 1 - 500 ГОСТ 1770-74.
3.1.18. Колба 2-50-2, 2-100-2, 1-1000 ГОСТ 1770-74.
3.1.19. Широкогорлые стеклянные или пластиковые флаконы емкостью 100 - 500 мл с притертым или завинчивающимися крышками.
3.1.20. Спиртовка.
3.1.21. Иглы препаровальные.
3.1.22. Ножницы с прямыми браншами.
3.1.23. Фильтровальная бумага.
3.2. Реактивы
3.2.1. Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72.
3.2.2. Сульфат алюминия [Al2(SO4)3].
3.2.3. Сульфат меди (CuSO4) х.ч.
3.2.4. Сульфат железа [Fe2(SO4)3] х.ч.
3.2.5. Оксид алюминия (Al2O3).
3.2.6. Древесный уголь БАУ-2.
3.2.7. Фуксин водорастворимый х.ч.
3.2.8. Карболовая кислота х.ч.
3.2.9. Этиловый спирт.
3.2.10. Твин-80.
3.2.11. Метиленовый синий сухой х.ч.
3.2.12. Иммерсионное масло.
3.3. Приготовление рабочих растворов реактивов
3.3.1. Карболовый фуксин: 1 г основного фуксина растворяют в 10 мл этилового спирта, раствор выливают в 100 мл 5-процентного раствора карболовой кислоты).
3.3.2. Солянокислый спирт: 3 мл соляной кислоты и 97 этилового спирта.
3.3.3. Водный 0,5-процентный раствор метиленового синего.
3.3.4. 0,002-процентный раствор Твин - 80: 1 мл концентрированного Твин - 80 растворить в 500 мл воды.
4. Отбор н хранение проб
Отбор проб питьевой воды и воды плавательных бассейнов по количеству и кратности проводят в соответствии с СанПиН "2.1.4. Питьевая вода и водоснабжение населенных мест. Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества. Санитарные правила и нормы СанПиН 10-124 РБ 99", раздел "паразитологический показатель".
Контроль воды подземных водоисточников по паразитологическим показателям может быть рекомендован при условии неоднократных неудовлетворительных микробиологических результатов исследования.
Количество проб и точек забора в распределительной сети утверждается по согласованию с санитарно-эпидемиологической службой при разработке рабочей программы с учетом численности водопотребителей.
Отбор проб воды производится в чистые емкости. Сосуды больших объемов - молочные фляги, металлические и пластмассовые ведра и т.п., тщательно промываются кипяченой водой и ополаскиваются отбираемой для анализа водой.
Пробы воды могут доставляться в лабораторию без обработки или, в целях облегчения их транспортирования, после предварительной обработки - концентрирования материала путем коагуляции и адсорбции с помощью таких коагулянтов, как сульфат алюминия, сульфат железа, сульфат меди и сорбентов - древесный уголь БАУ-2 или оксид алюминия.
В пробу воды на месте отбора одновременно добавляют один из коагулянтов и сорбентов в дозе 0,4 - 0,6 г/л, затем тщательно перемешивают и отстаивают 15 - 20 мин. После этого надосадочную жидкость удаляют, осадок переносят в сосуд объемом 1 л, доставляют в лабораторию и обрабатывают по нижеописанной методике.
Пробы, не прошедшие предварительную обработку, могут храниться при температуре 15 - 20 град. C не более двух суток.
5. Ход исследования
Питьевая вода исследуется в объеме не менее 50 л, вода водоисточников - в объеме не менее 25 л. В пробу воды одновременно добавляют один из коагулянтов (сульфат алюминия, сульфат железа, сульфат меди) и сорбентов (БАУ-2, Al2O3) в количестве 0,4 - 0,6 г/л, тщательно смешивают, оставляют на 15 - 20 мин. Надосадочную жидкость осторожно сливают, осадок энергично встряхивают и переносят в центрифужные пробирки, центрифугируют в течение 3 мин при 1000 об/мин. Воду сливают, к осадку добавляют по 6 - 8 мл 0,002-процентного раствора Твин-80. Смесь размешивают и вновь центрифугируют, надосадочную жидкость сливают в чистую пробирку, добавляют столько же воды и центрифугируют 3 мин при 1000 об/мин, надосадочную жидкость выливают, а осадок наносят на предметные стекла, высушивают на воздухе. Высушенный на воздухе осадок фиксируют над пламенем горелки, красят. При этом нужно избегать следующих ошибок: 1) изготовления слишком толстых препаратов; 2) фиксирования плохо высушенных мазков; 3) недостаточной фиксации; 4) длительной фиксации над пламенем.
Ход окраски. 1. На препарат кладут кусочек фильтровальной бумаги и наливают раствор карболового фуксина. 2. Препарат нагревают над пламенем горелки до появления паров, охлаждают и снова нагревают (3 раза). 3. Дают остыть, сбрасывают фильтровальную бумагу. 4. Опускают препарат в солянокислый спирт для обесцвечивания. Обесцвечивают до полного отхождения окраски. 5. Промывают водой. 6. Докрашивают препарат метиленовым синим 20 - 30 с. 7. Промывают водой и высушивают на воздухе. Микроскопируют с иммерсионной системой весь объем полученного осадка.
Ооцисты криптоспоридий окрашиваются в красный цвет, все остальные элементы и бактерии - в синий. При окраске по Цилю-Нильсену в красный цвет красятся также кислотоупорные сапрофиты. При окраске по Грамму ооцисты непрокрашиваются и остаются бесцветными (рис. 1, 2).
*****НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ
Рис. 1. Окраска по Граму (непрокрашенное округлое
образование, отмеченное стрелкой, является
ооцистой криптоспоридий)
*****НА БУМАЖНОМ НОСИТЕЛЕ
Рис. 2. Окраска на кислотоустойчивость по Цилю-Нильсену
(округлые образования, отмеченные стрелками, являются
ооцистами Cryptosporidium)
Микроскопирование и идентификация паразитарных патогенов в пробах воды должны выполняться специалистом, умеющим отличать их от фитопланктона и ооцист гидробионтов.
На обработку одной пробы требуется не менее 10 человеко-часов. Результат анализа может быть получен не ранее чем на следующий рабочий день после доставки пробы.
При микроскопировании подсчитывают число паразитарных патогенов во всем объеме осадка, что соответствует их числу в исследованной пробе.
| 
